Organická analýza - SPEKTRÁLNÍ METODY - UV-VIS spektrofotometrie

10 SPEKTRÁLNÍ METODY

10.1 UV-VIS spektrofotometrie

• 10.1.1 Princip metody
• 10.1.2 Vztah mezi elektronovým spektrem a strukturou molekuly
• 10.1.3 Kvalitativní analýza
• 10.1.4 Kvantitativní analýza
• 10.1.5 Instrumentace
• 10.1.6 Příklady stanovení
  • 10.1.6.1 Kapalinová chromatografie
  • 10.1.6.2 Analýza vody
  • 10.1.6.3 Klinická analýza
  • 10.1.6.4 Využití organických činidel pro analýzu organických látek
  • 10.1.6.5 Využití organických činidel pro analýzu anorganických látek

Kniha obsahuje přehled metod analýzy organických látek: Analytikům prohloubí jejich znalosti používaných metod a vedoucím pracovníkům poskytne podklady pro řešení úkolů jejich laboratoře. Je určena také pro studenty a vyučující univerzit a vědecké pracovníky.

💡 Kompletní obsah naleznete v odborné publikaci Organická analýza, kterou můžete zakoupit přímo u vydavatele 2 THETA, prostřednictvím LabRulez nebo v mnoha knihkupectvích.

Princip metody

Molekulová absorpční spektrofotometrie v ultrafialové a viditelné oblasti spektra se zabývá měřením elektronových spekter molekul látek absorbujících elektromagnetické záření v oblasti vlnových délek 200-800 nm (10-200 nm vzdálená, vakuová UV oblast, 200-400 nm blízká UV oblast, 400-800 nm viditelná oblast spektra). Při této absorpci dochází k excitaci valenčních elektronů, jež jsou součástí molekulových orbitalů. Změna stavu elektronového obalu molekuly je spojena také se změnou jejích vibračních a rotačních stavů. Přechod z nižší elektronové hladiny do vyšší může probíhat do různých vibračních a rotačních podhladin molekuly, a proto je počet elektronových přechodů u molekuly velký. Tyto přechody nelze rozlišit jako čárové a výsledkem měření absorpčního spektra molekul jsou proto absorpční pásy. Tvar pásu je symetrický s maximem při určité vlnové délce λmax. Absorpční spektra složitých molekul mívají více absorpčních pásů, které se často překrývají a tvoří absorpční křivky s nevýraznými maximy.

2 THETA: VIS spektrum

Vztah mezi elektronovým spektrem a strukturou molekuly

Ultrafialové nebo viditelné záření v oblasti 200-800 nm poskytuje dostatečnou energii k tomu, aby se vazebné elektrony δ nebo π excitovaly z molekulového orbitalu s nižší energií do molekulového orbitalu s vyšší energií. Stejně se excitují i elektrony volných elektronových párů. Podle stoupající energie molekulových orbitalů jsou energetické hladiny následující: vazebná δ - vazebná π - nevazebná n – antivazebná π* - antivazebná δ*. V důsledku energetické náročnosti těchto přechodů dochází k absorpci v různých oblastech vlnových délek – při nižší energetické náročnosti nastává absorpce ve viditelné oblasti spektra, při vyšší energetické náročnosti přechodů v ultrafialové oblasti spektra (Obr.).

2 THETA: Energetické změny při elektronových přechodech

Přechodu δ→δ* odpovídá velká změna energie; protože excitace elektronů δ je značně náročná, jedná se o molekuly bez volných elektronových párů (Obr. níže). Většina těchto absorpčních pásů se nachází ve vakuové UV oblasti. Protože tyto orbitaly δ jsou v jednoduchých vazbách (C-C, C-H), a to např. u nasycených uhlovodíků, neabsorbují tyto sloučeniny v blízké UV nebo viditelné oblasti spektra. Tyto sloučeniny jsou však velmi vhodnými rozpouštědly pro měření absorpčních spekter ostatních organických látek (n-heptan, n-hexan, cyklohexan, isooktan).

2 THETA: Elektronový přechod molekulárního vodíku - přechod δ→δ*, HOMO – nejvyšší obsazený molekulový orbital, LUMO – nejnižší neobsazený molekulový orbital [2]

Přechody n→δ* nebo n→π* vyžadují méně energie a proto se vyskytují u nasycených nebo nenasycených organických sloučenin s volnými elektronovými páry.

Přechody π→π* jsou nejběžnější, zejména u organických látek, kde excitace probíhá v jednotlivých nenasycených skupinách, tzv. chromoforech. To jsou skupiny atomů, které po zavedení do nasyceného uhlovodíku způsobují absorpci v rozmezí 180 – 1000 nm. Jedná se např. o skupiny -CHO, -NO, >CO, >CS, >SO. Konjugací dvojných vazeb se absorpční pásy π→π* posouvají k větším vlnovým délkám, tzv. batochromní posun; s rostoucím počtem dvojných vazeb narůstá i intenzita absorpce, hyperchromní posun. Přítomnost skupiny –CH₂- mezi násobnými vazbami má za následek znemožnění konjugace; podobně se chovají i skupiny –O- nebo –S-. Absorpční spektra organických látek ovlivňují také další atomová seskupení, tzv. auxochromy (-OH, -Cl, -Br, -I, -SH). Samy excitaci nepodléhají, avšak v konjugovaném π elektronovém systému způsobují batochromní posun, takže dojde k absorpci. Auxochromy mohou však také způsobit posun absorpce k nižším vlnovým délkám, hypsochromní posun, který je spojený buď se zvýšením absorpce nebo s jejím snížením, hypochromní posun.

2 THETA: Elektronové přechody

Se zvětšujícím se konjugovaným systémem se energetická mezera mezi orbitaly HOMO a LUMO zmenšuje natolik, že nastává batochromní posun a absorpce probíhá ve viditelné oblasti spektra.

2 THETA: Batochromní posuny absorpčních pásů vlivem konjugace [3]

Přechody přenosu náboje (charge-transfer komplexy) mají také významnou absorpci v UV-VIS oblasti spektra. Vykazují je dvojice organických látek, z nichž jedna se chová jako donor (D) a druhá jako akceptor (A) elektronů a vzájemně spolu interagují za výměny těchto elektronů a tvorby donor-akceptorového komplexu (DA). Tyto látky se mohou chovat jako Lewisovské kyseliny nebo báze, případně jako oxidačně-redukční systémy. Při absorpci fotonu se objeví absorpční pás, který je důsledkem přechodu elektronu ze základního vazebného orbitalu donoru π (nebo i nevazebného n) na protivazebný orbital akceptoru (intermolekulární elektronový π→π* nebo n→π*). Tento přechod je energeticky výhodnější než přechod v samotných složkách donoru nebo akceptoru. Vlnová délka λmax tohoto komplexu se proto nachází v oblasti vyšších vlnových délek než jsou λmax jednotlivých složek. To se může projevit zbarvením původně bezbarvých roztoků [4].

Charakteristickou absorpci vykazují aromatické sloučeniny, zejména benzen (Obr. níže) a jeho deriváty, heterocyklické sloučeniny a barviva.
Kromě výše uvedených možností ovlivňuje absorpční spektrum také použité rozpouštědlo (Obr. níže). Měřením stejné látky v rozpouštědlech s odlišnou polaritou lze rozlišit přechody n→δ* a n→π* od přechodu π→π*. V nepolárních rozpouštědlech dostaneme spektra s ostřejšími maximy, v polárních rozpouštědlech jsou přechody π→π* pozorovány při delších vlnových délkách a přechody n→δ* a n→π* při kratších vlnových délkách. Je to způsobeno solvatací nevazebných elektronů polárním rozpouštědlem a potřebou vyšší energie pro excitaci.

2 THETA: Absorpční spektrum benzenu v parách (____) a v ethanolu (….)

Obsahem této kapitoly je dále množství přehledových tabulek (Použitelnost organických rozpouštědel pro UV-VIS; Charakteristika chromoforních skupin; Charakteristika konjugovaných chromoforních skupin; Charakteristika konjugovaných polyenů a aldehydů; Charakteristika monosubstituovaných derivátů benzenu (ve vodě); Šestičlenné heterocykly; Pětičlenné heterocykly)

💡 Kompletní obsah naleznete v odborné publikaci Organická analýza, kterou můžete zakoupit přímo u vydavatele 2 THETA, prostřednictvím LabRulez nebo v mnoha knihkupectvích.

Kvalitativní analýza

Proměření spekter a jejich porovnání se známými spektry v knihovnách spekter umožňuje v některých případech charakterizovat a identifikovat neznámé organické látky. Tvar absorpční křivky je dán absorbovanou energií při elektronovém přechodu a souvisí se strukturou látky. Je ovlivněn přítomnými chromofory, ostatními substituenty, konjugací a také použitým rozpouštědlem. Poloha absorpčních pásů je charakteristická právě jen pro určitou část molekuly, a proto spektra strukturně si podobných molekul se od sebe jen málo liší. Identifikace dané organické látky pouze podle absorpčního spektra proto není jednoznačná a často musí být doplněna informacemi získanými použitím ostatních analytických technik (infračervená spektrometrie, nukleární magnetická rezonance, hmotnostní spektrometrie).Mnohem větší význam má metoda molekulové absorpční spektrofotometrie pro stanovení nízkých koncentrací rozpuštěných látek, než pro kvalitativní a strukturní analýzu. Kvantitativní analýza je založena na Lambert-Beerově zákoně.

Kvantitativní analýza

Lambert Beerův zákon vyjadřuje vztah mezi absorbovaným zářivým tokem, tloušťkou absorbujícího prostředí a koncentrací absorbující látky. Prochází-li svazek rovnoběžných paprsků o monochromatickém zářivém toku ϕ₀ homogenním prostředím o tloušťce l, dojde k absorpci a další část záření ϕ (ϕ<ϕ₀) z prostředí vychází. Propustnost, transmitance, se udává v % a je dána poměrem zářivého toku vycházejícího z absorbujícího prostředí k zářivému toku původnímu.

Při fotometrických titracích se využívá fotometrického sledování průběhu titrační závislosti a možnosti stanovení bodu ekvivalence. Titrační křivkou se rozumí závislost absorbance roztoku na objemu titračního činidla. Absorbance je sledována při konstantní vlnové délce, při které má jedna z reagujících složek charakteristickou absorpci. Na absorbující složce závisí tvar titrační křivky, ze kterého lze určit, zda absorbuje titrovaná látka, titrační činidlo nebo produkt jejich vzájemné reakce. Tato metodika má řadu výhod, protože lze stanovit také látky, které samy v UV-VIS oblasti neabsorbují a neruší přítomnost ostatních absorbujících látek. Kromě toho má tato metoda i dostatečně vysokou přesnost.

Instrumentace

K měření se používají UV-VIS spektrometry, které pracují obvykle v oblasti vlnových délek 190 – 1000 nm. Každý přístroj má tyto čtyři základní části:

• 1. zdroj záření,
• 2. monochromátor,
• 3. absorpční systém,
• 4. detektor záření.

Jako zdroj záření pro rozsah vlnových délek 180-360 nm se nejčastěji používá deuteriová výbojka, nad 360 nm wolframová nebo halogenová žárovka. V novějších přístrojích se pak uplatňuje xenonová výbojka jako kontinuální zdroj záření ve viditelné i ultrafialové oblasti. Výhodou jsou nižší nároky na údržbu a delší životnost zdroje záření. Nejjednodušším monochromátorem je zařazení interferenčního filtru do proudu paprsku. Nejčastěji je disperzní systém tvořen mřížkovým monochromátorem ve spojení se vstupní a výstupní štěrbinou (0,01 – 10 nm) s fixní nebo variabilní možností nastavení. Absorpční prostředí tvoří roztoky vzorků (nebo plyny) v kyvetách z plastu, skla (VIS oblast) nebo z křemene (UV oblast), přičemž je nutné, aby materiál kyvet neabsorboval ve sledovaném rozsahu vlnových délek. Tloušťka absorpční vrstvy bývá v závislosti na rozměru kyvet od 0,1 do 10 cm; nejčastěji je to 1 cm. Tloušťku kyvet volíme podle koncentrace analytu a v závislosti na molárním absorpčním koeficientu tak, aby naměřená hodnota absorbance A ležela v rozsahu 0,1 – 1. Pro speciální měření lze využít, zejména pro kontinuální průtokovou analýzu, také průtočných kyvet. Pro měření reakčních rychlostí bývá používán vesměs termostat, který temperuje kyvety na vhodnou konstantní teplotu. Absorpce plynů se měří ve speciálních válcových kyvetách s uzavíratelným otvorem. Pro detekci záření se používají fotoelektrické detektory citlivé na ultrafialové a viditelné záření, s výstupem na registrační zařízení, tiskárnu, PC. V novějších přístrojích se pak používají detektory s diodovým polem (Diode Array Detector, DAD), které snímají celé spektrum v reálném čase.

2 THETA: Použití DAD a vliv šířky štěrbiny na průběh spektra [11]

Příklady stanovení

Spektrofotometrie v UV-VIS oblasti spektra nalezla velmi rozsáhlé využití v organické analýze, například při analýze vzorků z životního prostředí, v klinické biochemii organických látek, při analýze potravin, léčiv apod. Molekulová absorpční spektra se uplatňují při identifikaci pesticidů, syntetických barviv, farmak a mnoha karcinogenních látek znečišťujících životní prostředí. Při analýze složitějších vzorků je však nutná izolace analytu vhodnou separační technikou (např. extrakce, destilace, chromatografická separace). Další významnou oblastí, kde nalézá tato metoda své uplatnění, je hodnocení čistoty různých organických látek.

Ve farmaceutickém průmyslu jsou UV/VIS spektrofotometry využívány ke kvalitativní i kvantitativní analýze, jsou nezbytnou instrumentací při kontrole čistoty a dávky léčivé látky v léčivu, např. při stanovení ibuprofenu. V biotechnologickém průmyslu se UV/VIS spektrofotometrie využívá ke kvantitativnímu stanovení proteinů, nukleových kyselin a ke kontrole čistoty DNA. Např. při vlnové délce 600 nm se měří optická hustota vzorku buněčné kultury s cílem odhadnutí počtu bakterií. V potravinářském průmyslu slouží UV/VIS spektrofotometrie ke kontrole kvality výrobků a k jejím zvyšování, nebo např. ke zjištění kontaminace nápojů (vinařský a pivovarnický průmysl). V chemickém průmyslu se využívá měření v UV i viditelné oblasti spektra, a to zejména ke kontrole čistoty organických látek/roztoků.

KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE

Absorpce organických látek v ultrafialové oblasti spektra se často využívá pro jejich detekci při jejich separaci metodou kapalinové chromatografie.

ANALÝZA VODY

Spektrofotometrii v UV oblasti lze s výhodou využít při stanovení některých skupin organických látek ve vodách. Jedná se zejména o sloučeniny s konjugovanými nenasycenými vazbami C=C, C=O, N=N a C=S, což jsou většinou aromatické sloučeniny. Z látek, vyskytujících se přirozeně ve vodách, to jsou zejména huminové kyseliny, aromatické uhlovodíky a ligninsulfonany. V průmyslových odpadních vodách pocházejících z organických výrob se může nacházet celá řada různých aromatických sloučenin, pro jejichž stanovení je tato metoda zvláště vhodná. Využívá se absorpčních maxim v oblastech 200 – 380 nm [14]. Tvar spekter závisí na počtu aromatických jader a na přítomných funkčních skupinách. Z praktických důvodů byla v analýze vody pro měření absorpce zvolena vlnová délka 254 nm. Zvýšené hodnoty naměřené absorbance ve vzorku vody mohou indikovat přírodní znečištění huminovými látkami nebo průmyslové znečištění aromatickými látkami.

KLINICKÁ ANALÝZA

Důležité informace poskytuje UV-VIS spektrofotometrie při identifikaci a studiu biochemicky významných látek, zejména sterolů, barviv, vitamínů apod. O tom, zda je možné využít absorpčních vlastností dané látky, nebo zda bude nutné provést její derivatizaci, rozhoduje konkrétní aplikace. Derivatizací se převádí stanovovaná látka na produkt s vysokým absorpčním koeficientem. Tento proces lze provést pomocí substituce, adice, eliminace nebo přesmykem. Jednou z významných oblastí aplikace je klinická chemie, kde bývají využity také enzymatické reakce, např. L-laktát lze stanovit po oxidaci koenzymem NAD⁺. Redukovanou formou NAD⁺ je NADH, jehož absorpce se měří při 340 nm. Je to koenzym odvozený od nikotinamidu – nikotinamidadenindinukleotid a nikotinamidadenindinukleotid fosfát. Každý se vyskytuje v redukované a oxidované formě NADH/NAD⁺ a NADPH/NADP⁺ [22].

VYUŽITÍ ORGANICKÝCH ČINIDEL PRO ANALÝZU ORGANICKÝCH LÁTEK

Převážná většina spektrofotometrických stanovení organických látek se zakládá na jejich interakci s organickými činidly, která lze rozdělit do skupin podle jejich chemických vlastností. Jsou to chlorhydriny, fenoly, fenolethery, naftoly a jejich deriváty, thioly, aldehydy, ketony, chinony a jejich deriváty, kyselina malonová a deriváty, anhydridy kyselin, aromatické nitrosloučeniny, aminové sloučeniny, diazoniové sloučeniny, dusíkaté heterocykly, sloučeniny hydrazinu, heterocyklické sloučeniny, organická barviva a mnoho dalších sloučenin. Přehlednou tabulku s konkrétními chemickými činidly a příklady jejich použití při spektrofotometrické analýze konkrétních organických látek uvádí Zýka a kol. [6].

VYUŽITÍ ORGANICKÝCH ČINIDEL PRO ANALÝZU ANORGANICKÝCH LÁTEK

Za zmínku stojí i velmi široké a historicky významné využití organických látek ve spektrofotometrické analýze anorganických látek, a to zejména při analýze kovů a nekovů, kde se využívá celé řady organických činidel. Tato organická činidla se dělí do skupin látek se sulfidickou skupinou (dithizon, dithiol, thiomočovina, diethyldithiokarbaman sodný) a do skupiny organických azobarviv (PAR 4-(2-pyridylazo)resorcinol a PAN 1-(2-pyridylazo)-2-naftol), poskytujících celou řadu významných reakcí. Dále je to skupina azolátek s arsonovou skupinou (arsenazo I, III, thoron) a skupina trifenylmethanových barviv (aluminon, brompyrogallolová červeň, chromazurol S, eriochromcyanin R, pyrokatechinová violeť, xylenolová oranž, methylthymolová modř, malachitová zeleň, brilantní zeleň, krystalová violeť, methylová violeť, rhodamin B). Dále to mohou být také deriváty antrachinonu (alizarin, chinalizarin), flavonová barviva (morin, kvercetin), nitrosonaftoly (1-nitroso-2-naftol), deriváty chinolinu (8-chinolchinolin) a deriváty fluoronu (fenylfluoron). Dalšími významnými organickými činidly jsou dimethylglyoxim, 1,10-fenanthrolin, pyrokatechol, difenylkarbazid atd. [6].