FTIR a Ramanova mikroskopie: Pokročilé možnosti akvizice a interpretace dat

O tom, jak jdou techniky FTIR a Ramanovy mikroskopie dopředu a jak se rozšiřuje využitelnost těchto technik jsme se rozepisovali již dříve:

• Nová FTIR-QCL technologie: Revoluce v infračerveném zobrazování (Chemagazín 2022/1. vydání)
• Nové možnosti infračervených mikroskopů ve vědě a průmyslu (Chemagazín 2021/1. vydání)
• Nové trendy v oblasti Ramanovy spektrometrie - kapitola Hybridní Ramanova mikroskopie (Chemagazín 2022/4. vydání)

V první části článku shrneme tyto průlomové technologie a následně na to navážeme a budeme se věnovat inovativním softwarovým funkcím pro interpretaci dat. 

Nové technologie v posledních letech

V poslední době jsme byli svědky hned několika pokroků, které posouvají limity těchto technik na novou úroveň. 

Za zmínku stojí především FTIR-FPA mikroskopie, která využívá plošného FPA (Focal-Plane-Array) detektoru. Jde o unikátní komponentu, kterou na trhu disponují pouze mikroskopy HYPERION II a LUMOS II od Německého výrobce Bruker Optics (viz obr. 1). Tyto plošné detektory oproti standartním jedno-elementovým detektorům obsahují pole až 128x128 detektorových elementů, a proto dokážou měřit rychlostí cca 15 tis. spekter/s. Tím v dosahují výrazně vyšší rychlosti mapování ploch. Tj. plocha, která by byla na klasickém FTIR mikroskopu měřena hodinu, trvá našemu mikroskopu pár vteřin (viz obr. 2).

Optik Instruments: FTIR a Ramanova mikroskopie - Pokročilé možnosti akvizice a interpretace dat: Obr. 1 – FTIR-FPA mikroskop LUMOS II (vlevo) a Ramanův mikroskop SENTERRA II (vpravo).

Ještě větší pokrok v tomto ohledu přinesla FTIR-QCL technologie, která místo klasického zdroje IČ záření (žhavený globar) používá kvantový kaskádový laser (QCL). Záření emitované QCL je mnohem intenzivnější, a proto je možné je detekovat méně citlivými detektory známými např. z infrakamer. Tím lze dosáhnou rychlosti měření dokonce 90.000 bodů/vteřinu. Porovnání různých přístupů měření 

Optik Instruments: FTIR a Ramanova mikroskopie - Pokročilé možnosti akvizice a interpretace dat: Obr. 2 – Infračervená chemická mapa řezu tkání o rozměrech 14.7 x 5.9 mm. Pomocí klasické FTIR mikroskopie by měření trvalo cca 130 hodin, s FTIR-FPA mikroskopií 113 minut, v případě FTIR-QCL mikroskopie je tato mapa změřena za 8 minut!

I v oblasti Ramanovy mikroskopie jsme svědky mnoha inovací – ty souvisejí zejména s dokonalejší elektronikou a jemnou mechanikou, kterou tyto optické přístroje disponují. Proto nejnovější Ramanovy mikroskopy umožňují velmi rychlý pohyb vzorku a akvizici dat rychlostí, která mnohdy přesahuje 100 spekter/s. Příkladem může být např. Ramanův mikroskop SENTERRA II (obr. 1) s rychlostí měření 130 spekter/s.

Co na to počítače?

Je jasné, že tyto unikátní přístroje svým měřením generují obrovský objem dat – mnohdy i miliony spekter, takže se v podstatě bavíme o miliardách datových bodů! Na všech spektrech počítač musí provádět matematické operace, musí umět spektra upravovat a zejména také vyobrazovat chemickou informaci v každém změřeném bodě/pixelu. 

Tomu, aby toto bylo možné, napomáhá dnešní výpočetní technika – velká interní paměť RAM, rozsáhlé TB disky k ukládání dat i výkonné procesory. Nutností je také 64 bit software, který nemá limitovaný tzv. paging file a dokáže tak pracovat s různě velkými soubory dat. Nejdůležitějším aspektem pro to dosáhnout potřebného výsledku a vytáhnout ze spekter žádoucí informace jsou (mimo zkušenou obsluhu) i softwarové nástroje a o těch se rozepíšeme v další kapitole.

Interpretace mikroskopických dat

Interpretace dat z FTIR i Ramanovy mikroskopie spočívá v tom, že v každém bodě máme změřené spektrum, které v sobě nese chemickou informaci. Každý bod v chemické mapě vybarvíme na základě nějakého atributu v tomto spektru. Typické je vybarvování na základě plochy pásu. Tj. pokud máme ve spektrech pásy C-H vazeb, čím více jsou tyto pásy přítomny, tím světlejší barvou se nám daný bod v mapě vybarví. Co když ale distribuce C-H vazeb v prostoru nepřinese dostatečnou informaci. Může se stát, že vůbec nevíme, na jakou část spektra se zaměřit, jaké látky se nám ve vzorku nacházejí a nebo dokonce o vzorku netušíme vůbec nic. Co potom? Pak přichází na řadu nejnovější verze spektroskopického softwaru OPUS, která disponuje velmi komplexním výčtem zajímavých funkcí, které nám pomohou jak se samotnou akvizicí dat, tak i s jejich vyhodnocením – pro představu tyto funkce uvádíme níže:

3D FOCUS FUSION – máte nerovný vzorek a nedaří se Vám zaostřit na větší plochu? Funkce 3D focus fusion vyfotí každou z oblastí zájmu se zaostřeným obrazem a snímky jednoduše spojí do jednoho ostrého snímku v celé ploše. Z-ovou souřadnici si navíc software zapamatuje i při měření, protože ohnisko je stejné pro viditelný snímek i pro měření pomocí IČ nebo Ramana. Nejen tedy, že můžete mít dokonale ostrý obraz, ale také maximálně kvalitní spektra. Ukázka na obr. 3:

Optik Instruments: FTIR a Ramanova mikroskopie - Pokročilé možnosti akvizice a interpretace dat: Obr. 3 – ukázka skladby zaostřeného obrázku pomocí funkce 3D FOCUS FUSION.

FIND REGIONS – chcete měřit jen v konkrétních bodech - např. jen částice na filtru? Není nic lehčího, než použít funkci Find regions, která Vám na základě kontrastu u klasického vizuálního snímku určí, kde částice leží a umístí do nich měřící body. Pokud tuto funkci zkombinujete i s funkcí MP-ID, každá částice je i automaticky identifikována a výsledkem je statistika identita vs. velikost částic.

SMART SPECTRAL CONTRAST – nevíte, kde se ve vzorku nacházejí rozdíly v chemismu? Použijte tuto funkci pro rychlou autonomní tvorbu vysoce kontrastního obrazu klidně i v reálném čase během FTIR a Ramanova mikroskopického měření.

ADAPTIVE CHEMICAL IMAGING – autonomní clusterová analýza, která pomocí zjednodušeného algoritmu nalezne spektrální rozdíly v mapě, včetně automatického přiřazení každého bodu do definovaných tříd/clusterů. Uživatel zkrátka dostane informaci o rozložení různých komponent v prostoru vč. průměrného spektra pro každou komponentu, aniž by o svém vzorku cokoliv věděl. V praxi se takto můžete dostat k velmi zajímavým mapám a také reprezentativním spektrům, bez jakékoliv znalosti vzorku. Ukázka využití funkce Adaptive chemical imaging na obr. 4.

Optik Instruments: FTIR a Ramanova mikroskopie - Pokročilé možnosti akvizice a interpretace datOptik Instruments: FTIR a Ramanova mikroskopie - Pokročilé možnosti akvizice a interpretace datOptik Instruments: FTIR a Ramanova mikroskopie - Pokročilé možnosti akvizice a interpretace dat: Obr.4 – ukázka uplatnění funkce Adaptive chemical imaging na vzorku kompozitního materiálu zalitého v pryskyřici (červená - PVC, zelená - PA, modrá – guma).

TABLET ANALYZER – tato funkce je dedikovaná pro sledování API v tabletách ve farmacii, avšak její využití se nabízí i v mnoha analogických aplikacích. Spočívá v tom, že do funkce nahrajete mapu tablety a spektra čistých látek, které ve vzorku čekáte. Funkce už vám automaticky vypočte procentuální zastoupení pro každou čistou složku. Výstupem je pak přehledný report.

Optik Instruments: FTIR a Ramanova mikroskopie - Pokročilé možnosti akvizice a interpretace dat: Obr. 5 – ukázka vyhodnocení distribuce API v tabletě (ibuprofen - zelená, mikrokrystalická celulosa-modrá a kofein-červená).

Toto je jen zevrubný přehled těch nejinovativnějších funkcí, ale každý měsíc až dva se od vývojářů dozvídáme o nových. Pokud Vás kterákoliv z funkcí zajímvá více, doporučujeme využít youtube kanál výrobce Bruker, kde jsou veškeré výše zmíněné funkce pěkně demonstrovány na reálných příkladech.

Jaká bude budoucnost?

Technologie jdou neustále dopředu a s rozvojem toho, co dnešní mikroskopy dovedou změřit jde logicky ruku v ruce i pokrok v softwarovém vybavení. Na několika nových a velmi inovativních funkcích spektroskopického softwaru OPUS jsme si ukázali, jaké jsou dnešní možnosti z hlediska zpracování chemických map a také to, že je v podstatě možné vytáhnout i velmi zajímavé informace ze zcela neznámých vzorků. Toto je směr, kterým se FTIR i mikroskopie bude do budoucna vyvíjet – až ke zcela autonomnímu vyhodnocení dat založeném na AI. My se u toho budeme snažit být s vámi a budeme vás i nadále informovat.