Guide to Biopharmaceutical Solutions — From Cell Line Optimization to Pharmacokinetics —

Význam tématu

Biologická léčiva a farmaceutické proteiny se vyznačují vysokou složitostí výroby i analýzy. Od optimalizace buněčné linky, přes kontrolu kultivačních podmínek a purifikaci, až po charakterizaci a stanovení stability a bezpečnosti konečného přípravku, je nutné využít špičkové analytické metody. Ty zajišťují spolehlivost, reprodukovatelnost a citlivost měření, minimalizují spotřebu vzorku a podporují dodržení přísných regulačních požadavků.

Cíle a přehled studie / článku

Prezentovaný průvodce popisuje integrované řešení Shimadzu pro biotechnologické workflow. Klíčové oblasti zahrnují:

• Optimalizaci buněčné linky (kvantifikace DNA/RNA, analýza kovových a chemických složek, automatizace předúprav)
• Purifikaci a analýzu proteinů (afinitní chromatografie, chromatografie s vyměnitelnými kolonkami, SEC, SDS-PAGE)
• Charakterizaci (spektroskopie UV-VIS, fluorescenční detekce, MALDI-TOF, FTIR, Edmanova sekvenace, peptidové mapování)
• Kontrolu jakosti (elementární analýza podle ICH Q3D, stanovení agregátů laserovou difrakcí, subvizibilní částice metodou obrazové analýzy)
• Farmakokinetiku (LC-MS/MS kvantifikace protilátek, metabolitů, biomarkerů, profilování střevního mikrobiomu GC/MS a LC/MS)

Použitá metodika a instrumentace

Celý řetězec procesů pokrývají tyto hlavní přístroje a metody:

• UV-1900i UV-VIS spektrofotometr s TrayCell/Nano Stick pro mikroobjemy DNA/RNA
• BioSpec-nano pro měření proteinů i nukleových kyselin z 1–2 µL vzorku, s automatickým otíráním
• MultiNA mikrochipová elektroforéza pro analýzu DNA/RNA včetně heteroduplexní mobility
• CELL PICKER pro robotizované sbírání kolonií při genome editingu
• AA-7000 AAS pro elementární analýzu kulturních médií (plamen/furnace)
• Nexera X3 + LCMS-8060 pro simultánní analýzu až 125 metabolitů (UF technologie)
• C2MAP-2030 pro automatickou předúpravu a přímé uvedení do LC-MS/MS
• Prominence inert LC + LH-40 pro integrovanou frakcionaci a SEC analýzu protilátek
• PPSQ-51A/53A pro N-terminální sekvenaci proteinů Edmanovou degradací
• MALDI-8020 a MALDImini-1 pro rychlou TOF MS analýzu proteinů, peptidů a glykokonjugátů, včetně MSn
• LC-2060 UHPLC pro precizní peptidové mapování trypsinových fragmentů
• IRTracer-100 FTIR se zanášecí ATR pro měření sekundární struktury proteinů
• RF-20Axs fluorescenční detektor a Aeris C18 kolony pro glykanovou analýzu
• ICPMS-2030 pro ultracitlivou elementární analýzu stopových kovů (Q3D)
• C18 kapsle nSMOL pro specifickou predigescenci Fab fragmentů a kvantifikace protilátek LC-MS/MS
• HS-20 trap + GCMS-QP2020 NX a GC-SCD-2030 pro analýzu těkavých biomarkerů mikrobiomu

Hlavní výsledky a diskuse

Výsledky potvrzují vysokou liniaritu, opakovatelnost a citlivost metod:

• UV-VIS kvantifikace DNA s R2 ≥ 0,999 při objemech 2–4 µL
• BioSpec-nano měření nukleových kyselin a proteinů z 1–2 µL s CV < 1,4 %
• MALDI-MS profilování glykoproteinů rozliší isomery a modifikace
• MultiNA detekuje indel mutace v genomovém DNA pomocí HMA
• C2MAP-2030 zkrátil čas předúpravy vzorků z desítek minut na < 12 min
• nSMOL LC-MS/MS kvantifikace protilátek v plazmě do 0,06 µg/mL s přesností ±10 %
• GC/MS a LC/MS metabolomika splňuje simulace metabolitů střevního mikrobiomu
• DSC a FTIR odhalují strukturální změny proteinů při termodenaturaci
• ICP-MS analýza tablet splňuje limity elementárních nečistot Q3D
• Dynamická obrazová analýza agregátů proteinů měří částice 0,1–10 µm v reálném čase

Přínosy a praktické využití metody

Automatizace a integrace nástrojů přináší:

• Minimalizaci pracovní zátěže a rizika lidské chyby
• Úsporu vzorku i činidel
• Zvýšení průchodnosti a reproducibility dat
• Komplexní trasovatelnost a plnění regulačních požadavků GMP/ICH

Budoucí trendy a možnosti využití

Předpokládané směry dalšího vývoje:

• Propojení s umělou inteligencí a strojovým učením pro prediktivní analýzy
• Miniaturizace a mikrofluidické platformy pro single-cell bioanalýzu
• Online monitorování v reálném čase a IoT konektivita fermentorů
• Integrované multi-omické přístupy (proteomika, lipidomika, metabolomika)

Závěr

Shimadzu řešení pokrývají kompletní biopharma workflow od optimalizace buněk až po PK studie. Kombinace vysoké citlivosti, robustnosti a automatizace je klíčová pro vývoj moderních biologických léčiv a zajištění jejich vysoké kvality a bezpečnosti.

Reference

• Yuk I.H. et al. Direct analysis of metallic elements in cell culture medium by AAS. Applied Microbiology & Biotechnology, 102, 5989–5999 (2018).
• Sun Z. et al. Monitoring CHO cell culture metabolites. Biologicals, 61, 144–151 (2019).
• Kovacs-Nolan J. et al. Thermal denaturation of egg white proteins. J. Agric. Food Chem., 53, 8421–8431 (2005).
• Nishikaze T. et al. Glycan MSn analysis with SALSA derivatization. Anal. Chem., 89, 2353–2360 (2017).
• Matsumoto M. et al. Gut microbial metabolites profiling by GC/MS and LC/MS. Scientific Reports, 2, 223 (2012).
• Iwamoto N. et al. nSMOL Fab-specific quantitation of trastuzumab. Analyst, DOI:10.1039/c3an02104a.
• Stubiger G. et al. MALDI profiling of extracellular vesicles. Analytical Chemistry, 90, 13178–13182 (2018).