Accelerate Your CQA Efficiency and Approach it with Multi-Attribute Methodology - Biopharma Compendium

Význam tématu

V oblasti vývoje a kontroly kvality monoklonálních protilátek (mAb) hrají analytické metody klíčovou roli při sledování kritických kvalitativních atributů (CQA), jako jsou agregace, glykosylace, deamidace, oxidace či mutace. Regulátoři vyžadují podrobné charakterizace strukturálních a posttranslačních modifikací, aby byla zajištěna bezpečnost a účinnost bioterapeutik.

Cíle a přehled studie

Text představuje soubor aplikovaných poznatků a řešení vyvinutých společností Agilent k rychlé a spolehlivé analýze mAb. Sdružuje několik přístupů: online 3D-LC/MS pro současné měření titeru, agregátů, hmotnosti a PTM; dvourozměrnou chromatografii pro agregaci a profil nabití; LC×LC-MS pro lokalizaci mutací v řetězcích; kvantifikaci deamidace a oxidace; a tříúrovňové řešení pro glykosylaci (intakt, subjednotky, peptidy a uvolněné oligosacharidy).

Použitá metodika a instrumentace

• Vícerozměrná LC (1D, 2D, 3D) kombinující protein A afinitu, SEC, WCX, RPLC, HILIC
• Agilent 1290 Infinity II 2D-LC / 3D-LC systémy s Quaternary a High-Speed pumpou
• Diode Array detektory a Jet Stream Q-TOF (Agilent 6530/6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF)
• Automatizace přípravy vzorků pomocí platformy AssayMAP Bravo
• Software MassHunter BioConfirm pro identifikaci, dekonvoluci a kvantifikaci
• Speciální sloupce: PLRP-S, AdvanceBio SEC, Bio MAb, Bio SCX, Glycan Mapping HILIC

Hlavní výsledky a diskuse

• Online 3D-LC umožňuje během 90 min současně měřit titer, agregáty (HMW/LMW), molární hmotu, PTM i glykosylační profil s přesností RT <0,2 a %RSD<1 %
• Dvourozměrná srdcovitá LC (SEC×WCX) zkracuje analýzu agregace i variant nabití na 13 min s RT a plošnou přesností <0,1 %
• LC×LC peptide mapping odhalilo dvojitou bodovou mutaci v heavy chain biosimiláru infliximabu (T→S, K→I) identifikovanou per‐reziduálně
• Metoda peptide mapping s BioConfirm kvantifikuje deamidaci Asn a oxidaci Met během stresu s časovým průběhem a RSD<1,5 %
• Workflow pro glykosylaci: intakt mAb dekonvoluce odhalí hlavní glykoformy G0F/G1F/G2F; subjednotky (HC/LC) detailní rozložení; HILIC LC×LC glykopeptidy lokalizaci N-glykozylací; uvolněné glykany s InstantPC značením, sepárací citlivost a kvantifikace >15 špiček glykanů

Přínosy a praktické využití metody

• Integrované a automatizované workflow šetří čas i pracovní kapacitu laboratoří.
• Vyšší průchodnost vzorků pro screening a QC procesů v bioprodukci.
• Přesné stanovení CQA podporuje rozhodování v procesu vývoje mAb i clone selection.
• Možnost souladu s regulatorními požadavky a validace metod pro GMP fáze.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další rozvoj multi‐attribute metod (MAM) s vyšší automatizací a AI‐powered datovou analýzou.
• Použití nových fází HILIC a ion‐mobility MS pro lepší separaci PTM a izomerů.
• On-line monitorování kritických atributů ve výrobní lince (Process Analytical Technology).
• Integrace s LIMS a cloudovými platformami pro centralizované řízení dat.

Závěr

Prezentované práce ukazují, že moderní kombinace 2D/3D LC, vysoce výkonné Q-TOF MS a robustní softwarové řešení umožňují komplexní a rychlou charakterizaci monoklonálních protilátek včetně detailního sledování glykosylace, agregace, oxidace, deamidace či mutací. Tyto přístupy významně zvyšují efektivitu analytických laboratoří a podporují vývoj a kontrolu kvality bioterapeutik.

Reference

1. Sandra K. et al. Modern Chromatographic and Mass Spectrometric Techniques for Protein Biopharmaceutical Characterization. J. Chromatogr. A 2014, 1335, 81–103.
2. Fekete S. et al. Chromatographic, Electrophoretic and Mass Spectrometric Methods for the Analytical Characterization of Protein Biopharmaceuticals. Anal. Chem. 2016, 88, 480–507.
3. Walsh G. Biopharmaceutical benchmarks 2018. Nat. Biotechnol. 2018, 36, 1136–1145.
4. Stoll D.R. et al. Characterization of Therapeutic Antibodies and Related Products by Two-Dimensional Liquid Chromatography Coupled with UV Absorbance and Mass Spectrometric Detection. J. Chromatogr. B 2016, 1032, 51–60.
5. Diepold K. et al. Simultaneous Assessment of Asp Isomerization and Asn Deamidation in Recombinant Antibodies by LC-MS following Incubation at Elevated Temperatures. PLoS One 2012, 7, e30295.
6. Robinson N.E.; Robinson A.B. Prediction of Primary Structure Deamidation Rates of Asparaginyl and Glutaminyl Peptides through Steric and Catalytic Effects. J. Pept. Res. 2004, 63(5), 437–448.
7. Rademacher T.W.; Williams P.; Dwek R.A. Agalactosyl Glycoforms of IgG Autoantibodies Are Pathogenic. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1994, 91, 6123–6127.