Using the Spectral Evaluation Function for Quantitative Analysis of Nucleotides and a Simultaneous Pass/Fail Judgment on Nucleotide Sample Purity

Význam tématu

UV-Vis spektrofotometrie umožňuje rychlou a spolehlivou kvantifikaci nukleových kyselin na základě absorpce světla dle Beer-Lambertova zákona. Současně poskytuje informace o čistotě vzorků, což je zásadní pro molekulárně biologické aplikace, jako je sekvenování nebo termická analýza.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo ukázat, jak využít Spectral Evaluation Function v softwaru LabSolutions UV-Vis na spektrofotometru UV-1900i Plus k:

• kvantitativní analýze oligonukleotidů pomocí kalibračních křivek,
• automatickému hodnocení čistoty vzorku podle poměru OD260/OD280.

Použitá instrumentace

• UV-1900i Plus UV-Vis spektrofotometr (Shimadzu)
• Software LabSolutions UV-Vis
• Super-micro držák kyvet
• 10 mm mikro černá kyveta

Použitá metodika

Spektra oligonukleotidů M13-F25mer byla měřena v rozmezí 220–400 nm s datovým intervalem 0,5 nm, střední rychlostí skenu a štěrbinou 1 nm. Vzorky byly připraveny ředěním na koncentrace 0,2–10,0 ng/µL. V Spectral Evaluation Function byly nastaveny:

• Point Pick pro absorbanci při 260 nm (pevná vlnová délka),
• Peak pro detekci maxima absorpce v uživatelem definovaném rozsahu,
• Výpočet poměru OD260/OD280 pro posouzení čistoty nukleových kyselin.

Hlavní výsledky a diskuse

• Kalibrační křivky: koeficienty determinace r² = 0,99969 (pevná 260 nm) a r² = 0,99992 (maximum absorpce) ukazují lepší linearitu při použití maxima.
• Posun vlnové délky maxima absorpce s koncentrací podtrhuje nutnost adaptivního nastavení kalibrace.
• Hodnocení čistoty: vzorky s poměrem OD260/OD280 ≥ 1,8 prošly, zatímco vzorek s příměsí albuminu (poměr 1,3) selhal.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje v jednom kroku stanovit přesnou koncentraci nukleových kyselin a posoudit čistotu vzorku, čímž zjednodušuje laboratorní workflow a zvyšuje spolehlivost dat. Je vhodná pro přípravu vzorků k sekvenování, termální stabilitě (Tm) nebo termodynamické analýze.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace AI pro adaptivní výběr vyhodnocovacích parametrů spekter.
• Rozšíření aplikace na jiné biologické makromolekuly či komplexní směsi.
• Využití v high-throughput prostředích a propojení na cloudové platformy pro sdílení dat.
• Implementace volitelného barevného modulu pro rozšířené spektrální hodnocení.

Závěr

Spectral Evaluation Function v kombinaci s UV-1900i Plus a LabSolutions UV-Vis představuje robustní nástroj pro simultánní kvantitativní analýzu a kontrolu čistoty nukleových kyselin, přičemž využití maxima absorpce zvyšuje přesnost výsledků.

Reference

1. L. Braglia, S. Giani, D. Breviario, F. Gavazzi: Anal. Bioanal. Chem., 408, 8299 (2016).