Meet Aunty – the Queen of protein stability

Význam tématu

Proteinová stabilita je klíčová pro vývoj biologických léčiv a jejich kvalitu. Rychlé a spolehlivé stanovení bodu tání a agregace umožňuje optimalizovat formulace, konstrukty a úpravy proteinů. Vysokopropustná metoda s nízkou spotřebou vzorku zrychlí rozhodovací procesy v QA/QC i výzkumu.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo představit platformu Aunty, která kombinuje fluorescenční měření, statickou a dynamickou světelnou disperzi v jednoho 96-well formátu. Studie demonstruje metody pro stanovení bodu tání Tm, počátku agregace Tagg, velikosti a polydisperzity částic, kolloidní stability a stability virových kapsid.

Použitá metodika a instrumentace

• Platforma Aunty s 96 kuželovými deskami z křemenného skla
• Full-spectrum fluorescence (intrinsická i barviva SYPRO Orange a SYBR Gold)
• Statická a dynamická světelná disperze (SLS a DLS)
• Termostatovaný modul 15–95 °C s možností ramp 0,1–10 °C/min a izoterm

Hlavní výsledky a diskuse

• Thermal ramp (Tm & Tagg): Trastuzumab vykázal Tm ~71 °C a Tagg 76–79 °C při 25 µg/mL a 1 mg/mL, resultáty srovnatelné s DSC.
• Sizing & polydisperzita: NIST polystyrenové kuličky 20, 100 a 500 nm odpovídaly očekávanému rozsahu; PDI ≤0,1.
• Thermal ramp s DLS: NISTmAb ukázala dvě Tm 69,7 °C a 83,5 °C, bez významné agregace.
• Reporter dye: Boviní IgG v PBS se SYPRO Orange dala Tm 71,5 °C a Tagg 69,9 °C.
• Capsid stability: AAV9 s SYBR Gold detekovala uvolnění genomu při 60,6 °C a agregaci kapsid při 76,3 °C.
• Kolloidní stabilita: Trastuzumab ve histidinu se sucrosou měl kladné kD a B22, v přítomnosti NaCl vznikly negativní kD a nižší B22; mAb1 v vyšších koncentracích podle G22 vykazovala repulzivní interakce.
• Izotermní stabilita: Boviní IgG při 62 °C ukázala, že arginin urychluje unfolding, ale omezuje agregaci.

Přínosy a praktické využití metody

Platforma umožňuje 96 měření za minutu, spotřebu 8 µL vzorku, snadnou automatizaci a širokou škálu aplikací pro screening stability proteinů i virových vektorů. Kombinace ortogonálních detekčních metod zkracuje vývojové a QC cykly.

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace s LIMS, rozšíření na další biologika a nanomateriály, vývoj nových barviv, modulů pro real-time sledování dlouhodobé stability a AI-podporovaná analýza dat.

Závěr

Aunty představuje komplexní řešení pro rychlou, citlivou a vysoce propustnou charakterizaci termální a koloidní stability biologik i virových vektorů, s přesným a reprodukovatelným hodnocením při minimální spotřebě vzorku.

Reference

• Biophysical Techniques for Characterizing the Higher Order Structure and Interactions of Monoclonal Antibodies, Y Gokarn et al., ACS Symposium Series 1201 (2015) s. 285–327.
• Weak interactions govern the viscosity of concentrated antibody solutions: High-throughput analysis using the diffusion interaction parameter, BD Connolly et al., Biophysical Journal 103(1) (2012):69–78.
• Colloidal Behavior of Proteins: Effects of the Second Virial Coefficient on Solubility, Crystallization and Aggregation of Proteins in Aqueous Solution, W Wilson et al., Curr. Pharm. Biotechnol. 6(6) (2006):427–436.
• Reexamining protein-protein and protein-solvent interactions from Kirkwood-Buff analysis of light scattering in multi-component solutions, MA Blanco et al., Journal of Chemical Physics 134(22) (2011).
• Protein-excipient interactions: Mechanisms and biophysical characterization applied to protein formulation development, TJ Kamerzell et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 63(13) (2011):1118–1159.
• Recombinant AAV genome size effect on viral vector production, purification, and thermostability, N Ibreljic et al., Molecular Therapy Methods & Clinical Development 32 (2024):101188.