Skip the mess with dye-free LNP payload quant on Stunner

Význam tématu

V oblasti vývoje lipidových nanopartiklí (LNP) pro dodání nukleových kyselin je klíčové rychlé a spolehlivé stanovení velikosti částic, distribuce a obsahu RNA. Tradiční fluorescenční testy založené na barvivech bývají časově náročné, nákladné a vyžadují komplikovanou přípravu vzorků.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo demonstrovat, jak přístroj Stunner kombinuje rotační úhel dynamické rozptylové spektroskopie (RADLS) a UV/Vis spektroskopii pro simultánní měření velikosti, PDI, koncentrace a zapouzdřené RNA v LNP. Studie porovnala výsledky s klasickou RiboGreen assay při testování LNP formulací připravených v mikrofluidickém systému Sunscreen.

Použitá metodika a instrumentace

• Stunner (Unchained Labs): RADLS pro víceúhlovou DLS analýzu, Unmix algoritmus pro separaci UV/Vis signálů RNA, lipidů a zákalu, mikrofluidické 96-well desky (2 µL vzorku).
• Klasická fluorescenční assay: RiboGreen nebo SYBR Gold, mikroplátková čtečka (Ex 485 nm/Em 528 nm), TE buffer, kalibrační řady a vzorky s a bez surfaktantu.
• Formulace LNP: mikrofluidický systém Sunscreen, reakční pufry citrate vs. acetate (20 mM, pH 4.0), PolyA nebo mFLuc mRNA payload, dialýza 20K MWCO kazetami.

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza ukázala, že pufr acetate vedl k menším a homogennějším částicím (Z-average <100 nm, PDI <0,2) než citrate. Počet částic se pohyboval kolem 1 × 10¹²/mL, s výjimkou LNP-Z v citrate, kde větší velikost snižovala koncentraci částic. Měření celkové RNA pomocí Stunneru souhlasilo s hodnotami z RiboGreen do 1 % a hybridní metodika zkrátila počet pipetovacích kroků z 266 na 114. Encapsulační efektivita (EE %) byla u všech vzorků vyšší než 90 %. Stunner navíc umožnil sledovat ztráty RNA během dialýzy a odhadnout celkový výtěžek enkapsulace.

Přínosy a praktické využití metody

Hybridní postup Stunner-RiboGreen zkracuje dobu analýzy až o 50 %, redukuje potřebu drahých barviv a zjednodušuje workflow bez ztráty přesnosti. Umožňuje vysokopropustný screening LNP formulací, rychlé vyhodnocení kvality částic a kvantifikaci RNA v jediném kroku.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj by mohl zahrnovat integraci automatizovaných formulátorů a analytických platforem pro real-time monitoring procesů výroby LNP, použití vlastních RNA analyzátorů pro neobvyklé sekvence a využití AI pro predikci stability a výtěžku enkapsulace.

Závěr

Přístroj Stunner přináší novou úroveň efektivity a komplexity analýzy lipidových nanopartiklí s RNA. Kombinace RADLS a UV/Vis separace signálů umožňuje přesné stanovení velikosti, PDI, koncentrace částic a zapouzdřené RNA v jediném workflow, což šetří čas, náklady a zvyšuje datovou kvalitu.

Reference

Unchained Labs (2024) APPLICATION NOTE: Skip the mess with dye-free LNP payload quant on Stunner, Rev B.