Stanovení nanočástic SiO₂ v biologických matricích s využitím Agilent 8900 ICP-QQQ

V posledních letech narůstá využití nejrůznějších nanomateriálů ve velmi širokém spektru aplikací. Nanočástice, tedy částice o velikosti v řádu 1-100nm, nacházejí své uplatnění zejména v lékařství, kosmetice, textilním a potravinářském průmyslu. Nano-měřítko dává částicím, ať už přírodním, a nebo uměle vytvořeným, unikátní fyzikální a chemické vlastnosti.

Nanočástice, tedy částice o velikosti v řádu 1-100 nm, nacházejí své uplatnění zejména v lékařství, kosmetice, textilním a potravinářském průmyslu. Nano-měřítko dává částicím, ať už přírodním, a nebo uměle vytvořeným, unikátní fyzikální a chemické vlastnosti. Za zmínku stojí obrovský aktivní povrch vůči celkovému objemu částic, s ním související vysoká reaktivita, velký počet aktivních vazebných míst, na která mohou vázat další látky, tvorba shluků, v jejichž kavitách mohou uzavírat jiné atomy či molekuly a fungovat tím jako biologické přenašeče, a mnoho dalších. Co do velikosti jsou nanočástice řádově menší než jednotlivé buňky.

Mohou prostupovat přes biologické membrány a aktivně působit přímo v buněčných organelách například degradovat proteiny (Ag), působit oxidativní stres (Fe, Ag, TiO₂), blokovat buněčné membrány (CuO, SiO₂ ), katalyticky ovlivňovat biochemické reakce (Fe) a další.

Mezi nejpoužívanější nanočástice patří částice stříbra (výživové doplňky, lékařské pomůcky, hygienické potřeby a textilie s antibakteriální ochranou), oxid titaničitý (bělící složka kosmetických přípravků, výživové doplňky, katalyzátory se samočistícím povrchem), oxid křemičitý (barvy, potravinové přísady, povrchové úpravy materiálů), oxid zinečnatý (ochrana před UV zářením) nebo zlato (výživové doplňky, kosmetické prostředky, katalyzátory). Odhaduje se, že roční produkce nanočástic se pohybuje v řádu stovek tisíc tun. I přes takto vysokou produkci a širokou škálu uplatnění toho zatím víme jen velmi málo o vlivech nanočástic na organismy, populace, ekosystémy i celé životní prostředí.

Samozřejmě již existují studie popisující negativní vliv nanočástic některých prvků na vybrané organismy. Bylo například prokázáno, že u ředkviček vystavených působení nanočástic mědi (60-100nm) o koncentraci běžně se vyskytující v odpadních vodách docházelo ke zvýšenému výskytu tvorby lézí, horší odolnost vůči plísním a k poškození DNA. Celkové množství mědi absorbované kořeny bylo násobně vyšší v porovnání s paralelními rostlinami vystavenými působení mědi v iontové formě o stejné koncentraci. U pstruhů, jejichž embrya byla vystavena nanočásticím stříbra (<30nm), bylo prokázáno ukládání stříbra v mozku, vývojové deformace a úhyn v raném věku. Dá se předpokládat podobně negativní vliv i u jiných významnějších zemědělských plodin i dalších živočišných druhů, člověka nevyjímaje.

Vzhledem k výše uvedeným skutečnostem narůstá zájem vědeckých týmů nejen o fyzikálně-chemické vlastnosti nanočástic a jejich využitelnost v praxi, ale v poslední době také o jejich vliv a dopady na životní prostředí. Hledají se metody, kterými by bylo možné spolehlivě a dostatečně rychle změřit počet nanočástic, a také další veličiny, jako velikost a tvar nanočástic, případně distribuci velikostí, prvkové složení nanočástic, koncentraci prvků v rozpuštěné formě a podíl shluklých částic. Důraz je kladen na jednoduchost, robustnost a přesnost stanovení.

spICP-MS

Řešení všech těchto požadavků na měření nanočástic přináší stanovení na ICP-MS v režimu „Single Particles“ (spICP-MS). Jedná se o jednoduché uspořádání, kdy je homogenizovaný vzorek nanočástic rozptýlených v roztoku přímo nasáván kapilárou do zmlžovače ICP-MS. Výsledkem je časový záznam s pulsy signálu - spiky, které odpovídají jednotlivým nasátým nanočásticím. Intenzita pulsu = výška spiku je úměrná velikosti nanočástice. Pulsy jednotlivých nanočástic trvají přibližně 200–500µs, přičemž spolehlivé výsledky je možné vyhodnotit už ze záznamu trvajícího méně než 1 minutu. Záznam je možné v software MassHunter s instalovaným modulem pro vyhodnocení nanočástic statistickými operacemi převést na histogramy distribuce intenzit signálu a distribuce velikosti nanočástic.

Altium: Obrázek 1. Nanočástice

Z nich se pak dále získají informace o průměrné velikosti částic, koncentraci částic a koncentraci prvku ve formě částic, koncentraci prvku v rozpuštěné iontové formě a minimální měřitelnou velikost částic. Případné shluky či aglomeráty částic se zobrazí jako pulsy s násobnou intenzitou, takže jsou snadno identifikovatelné.

ICP-MS je víceprvková metoda a v uspořádání spICP-MS tomu není jinak. Je tedy možné stanovovat směsi nanočástic různých prvků v jednom vzorku, nebo dokonce směsné nanočástice tvořené různými prvky. Pro získání přesných výsledků a dosažení co nejmenšího rozměru měřitelné částice je samozřejmě nutné mít správně připravené vzorky i měřící podmínky přístroje. Koncentrace částic ve vzorku by neměla být vyšší než řádově 108 částic/litr. Při vyšších koncentracích hrozí, že i v dobře homogenizovaném vzorku budou částice putovat do přístroje příliš rychle za sebou a jinak diskrétní pulsy se budou slévat do shluků.

Tím nejkritičtějším místem v technice spICP-MS je bezesporu důkladné ladění na co nejvyšší citlivost sledované hmoty prvku. Na rozdíl od roztokové analýzy, kde intenzita je přímo úměrná koncentraci, částice jsou prostorové útvary, a proto intenzita signálu klesá nebo roste s třetí mocninou rozměru částice. Jinými slovy - kdyby všechny částice měly ideální kulovitý tvar, částice o polovičním průměru by poskytovala 1/8 signálu v porovnání s původní částicí.

Kromě naladění přístroje na maximální citlivost a minimální šum je pro stanovení nanočástic nutné znát také účinnost zmlžování, průměr hadičky peristaltické pumpy a rychlost nasávání vzorku hadičkou. Dále je nutné systém nakalibrovat standardem obsahujícím příslušné nanočástice definovaného rozměru a koncentrace a zároveň obsahujícím prvek v iontové formě také o známé koncentraci.

K tomuto účelu se dají použít již komerčně dostupné standardní roztoky různých nanočástic. Schopnost spolehlivě změřit nanočástice o co nejmenší velikosti je pochopitelně jedním z hlavních požadavků na metodu. Nezávisí však pouze na maximální citlivosti přístroje, ale také na hodnotě signálu pozadí mezi jednotlivými pulsy. Ten totiž hlavně určuje minimální měřitelnou velikost částice – Background Equivalent Dimension (BED).

Signál pozadí je tvořen třemi hlavními složkami:

• a) koncentrace rozpuštěné formy prvku

• b) intenzita interferencí

• c) šum

Je tedy snahou před samotným měřením nastavit takové podmínky, které by všechny tři složky minimalizovaly. Nejjednodušší práce je s koncentrací rozpuštěné formy, kterou můžeme výrazně snížit naředěním vzorku. To se totiž vůbec neprojeví na výsledcích samotných nanočástic. Distribuce velikosti bude i po zředění zachována a koncentrace částic se snadno spočítá podle zřeďovacího faktoru. Šum se dá minimalizovat správně zvoleným typem zmlžovače a dobře nastavenými podmínkami vstupu vzorku včetně seřízeného nasávání vzorku. Nejsložitější je situace s odstraněním interferencí, jejichž příspěvek k signálu pozadí bývá často tím nejvýraznějším. Matriční interference se dají také minimalizovat naředěním vzorku. Je však řada interferentů, které vznikají přímo z argonu, složek vzduchu nebo vody a takové interference se ředěním odstranit nedají.

Pro dokonalé a snadné odstranění problematických interferencí lze s výhodou využit nejnovější tandemový MS/MS hmotnostní spektrometr s indukčně vázaným plazmatem ICP-QQQ 8900 Agilent Technologies, jehož použití si v tomto článku podrobněji ukážeme.

Altium: Obrázek 2. Ukázka vyhodnocení záznamu signálu nanočástic v software MassHunter

Altium: Obrázek 3. ICP-QQQ 8900

ICP-MS/MS 8900

Jedná se o druhou generaci ICP-QQQ přístroje, která je vylepšena o technologie uvedené a praxí ověřené už u přístroje Agilent ICP-MS 7900. Oproti původní verzi 8800 se může nový model Agilent 8900 ICP-QQQ pochlubit zejména delší oktopolovou kolizně-reakční celou umožňující ještě efektivnější odstranění interferencí, off -axis umístěným detektorem minimalizujícím šum, a především novou elektronikou detektoru, která umožňuje nastavit minimální integrační dobu (Dwell time) 100µs. Tím v sobě slučuje možnosti nejcitlivějšího ICP-MS systému na trhu s bezkonkurenčním odstupem signálu a šumu, a unikátní technologie odstranění interferencí pomocí kolizní/reakční cely umístěné mezi dva plnohodnotné kvadrupolové hmotnostní fi ltry, tedy ICP-MS/MS. Stává se tak nejefektivnějším nástrojem pro přesnou detekci nanočástic minimální velikosti.

Technologie a princip funkce ICP-MS/MS včetně jednotlivých režimů měření již byly podrobněji popsány v článku vydaném ve třetím čísle tohoto časopisu (Tandemová hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem (ICP MS/MS) – analýza bez interferencí).

Jen ve stručnosti - ICP-MS/MS díky své konstrukci umožňuje na prvním kvadrupolu odseparovat hmotu analytu (včetně interferujících látek o stejném poměru hmoty a náboje) od ostatních iontů). V oktopolové cele se kolizním mechanismem či chemickou reakcí interferent rozbíjí (v případě polyatomických iontů), nebo s využitím rozdílných reakčních entalpií chemických reakcí vytváří z interferentu nebo analytu směsný produkt stejně jako běžné ICP-MS s reakční celou. Analyt na stejné hmotě, nebo na hmotě výsledného produktu pak na druhém kvadrupolu vychází a ostatní hmoty odpovídající interferujícím iontům jsou odfiltrovány. Na rozdíl od běžných ICP-MS s jedním kvadrupolem však do chemické reakce vstupují výhradně předem vybrané ionty o přesném poměru hmoty a náboje, takže výsledné produkty jsou přesně známé a nehrozí riziko vzniku sekundárních interferencí. Na detektor pak z druhého kvadrupolu vycházejí skutečně pouze ionty analytu absolutně oproštěné od interferujících iontů. Viz Obrázek 4.

Uvedení nového modelu 8900 znamená pro instrumentaci ICP-MS/MS kromě jiného důležitý benefit v podobě zkráceného minimálního integračního času z původních 3ms na 100µs. Tento zdánlivý detail přináší výrazné zpřesnění právě při měření nanočástic. Jak bylo uvedeno výše, obvyklý signální puls jedné nanočástice trvá 200–500µs. S integrační dobou 100µs je tak možné oscanovat signální puls 4-7 body a vyhodnotit jeho intenzitu mnohem přesněji jako pík.

Altium: Obrázek 4. Základní princip funkce ICP-MS/MS

U modelu ICP-MS/MS 8800 je minimální integrační doba 3ms a ta umožňuje snímat signály v podobě diskrétních „oken“ s délkou 3ms.

Uvedení nového modelu 8900 znamená pro instrumentaci ICP-MS/MS kromě jiného důležitý benefit v podobě zkráceného minimálního integračního času z původních 3ms na 100µs. Tento zdánlivý detail přináší výrazné zpřesnění právě při měření nanočástic.

Jak bylo uvedeno výše, obvyklý signální puls jedné nanočástice trvá 200–500µs. S integrační dobou 100µs je tak možné oscanovat signální puls 4-7 body a vyhodnotit jeho intenzitu mnohem přesněji jako pík.

Signální pulsy pak ukazují celkovou intenzitu 48 v tomto jednom časovém okně. Může se stát, že do jednoho signálního okna „spadne“ více nanočástic a celkový signál je pak falešně násobně větší. Také se může stát, že signál jedné nanočástice je rozdělen do dvou signálních oken a to pak vede k zobrazení dvou částic s menším rozměrem. Díky statistickému zpracování naměřených dat v software MassHunter jsou tyto mezní případy sice zobrazené, ale pro vyhodnocení mediánu ne až tak podstatné. Klesá tím přesnost stanovení, ne však správnost.

Podle výše uvedeného by se mohlo zdát, že kratší integrační doba vždy vede k přesnějším výsledkům, není tomu tak a tento princip neplatí absolutně. Zkrácením integrační doby se sníží intenzita signálu pulsu. Ta, jak známo, klesá s třetí mocninou velikosti částice. S kratší integrační dobou klesá samozřejmě i signál pozadí, ale ten klesá lineárně (s výjimkou šumu). Zkrácení integrační doby pod 100µs již vede k zhoršení odstupu signálu od šumu a k nárůstu BED, neboli minimální detekovatelné velikosti částice. Integrační doba 100µs je dobrým kompromisem pro zachování dostatečné intenzity signálních pulsů a zároveň poskytuje dostatečný počet bodů při scanování pulsu jako píku.

Nutno podotknout, že integrační doby v rozmezí 200-1000 µs jsou pro potřeby stanovení nanočástic nepoužitelné. Pro scanování pulsu jako píku jsou příliš dlouhé a poskytují málo bodů, pro snímání celých částic je signální okno naopak příliš krátké a tak statisticky významné množství signálů částic je rozdělené do více oken, což je příčinou velmi nepřesných výsledků.

Analýza nanočástic SiO₂ na přístroji ICP-QQQ 8900 v režimu „Single Particles“

Oxid křemičitý nachází uplatnění v řadě odvětví. Ve formě nanočástic se využívá například jako plnivo do nejrůznějších barev, v potravinářském průmyslu se přidává do většiny instantních potravin jako protispékavá látka a látka bránící vlhnutí, dále jako nosič aroma. Hojně se využívá i jako brusidlo a leštidlo při povrchových úpravách materiálů. Vzhledem k takto širokému použití je potřeba monitorování výskytu nanočástic SiO₂ a jeho vlivu na životní prostředí na místě. Křemík se na běžném ICP-MS neměří úplně snadno. Jeho hlavní izotop 28Si (relativní abundance 92.23%) je zatížen několika významnými interferencemi ze vzduchu a matrice, zejména ¹²C¹⁶O⁺ a ¹⁴N₂⁺ .

Tyto interference pozadí se výrazněji projevují zejména při měření nízkých koncentrací křemíku. Jejich důsledné odstranění je proto kritické pro přesné měření nanočástic a zejména dosažení co nejmenší detekovatelné velikosti částic oxidu křemičitého. Při měření na ICP-MS k odstranění interferencí na ²⁸Si⁺ dobře poslouží vodíkový reakční mód. Absolutní jistotu odstranění všech interferencí a zabránění vzniku sekundárních interferencí, jako například ²⁷Al¹H⁺ poskytuje pouze měření na ICP-MS/MS. V režimu „On-Mass“ je prvním kvadrupolem vybrána hmota 28 (společná pro Si⁺, CO⁺, N₂⁺, AlH⁺, Feⁱⁱ⁺ a další možné ionty), v reakční cele s použitím vodíku jako reakčního plynu interferenty reagují za vzniku jiných iontů, nebo se rozpadnou na ionty o menší hmotnosti. Na druhém kvadrupolu opět prochází hmota 28 odpovídající už pouze křemíku. Viz Obrázek 5.

Aplikační nóta popisuje stanovení směsi nanočástic SiO₂ různé velikosti v matrici 1% etanolu. Etanol byl použit kvůli obsahu organického uhlíku jako model matrice reálných vzorků biologického původu, farmaceutických substancí či různých organických rozpouštědel, ve kterých se nanočástice SiO2 stanovují. Měření bylo provedeno na ICP-QQQ 8900 snímáním časového záznamu (TRA) s použitím integračního času 0.1 ms a celkovou dobou analýzy 30s. Signál ²⁸Si byl měřen ve vodíkovém reakčním modu v režimu MS/MS pro efektivní odstranění všech interferencí. Podrobné podmínky nastavení přístroje shrnuje Tabulka 1. Postupně byly měřeny vzorky obsahující jen demineralizovanou vodu, 1% etanol, a pak nanočástice o velikosti 50nm, 60nm, 100nm a 200nm o koncentraci Si ve formě částic 40ng/l, 40ng/l, 100ng/l respektive 1000ng/l v matrici 1% etanolu. Signál pozadí demineralizované vody a 1% etanolu dosahoval stejné úrovně 2.5 x 10⁴ cps, takže nežádoucí vliv uhlíku byl kompletně odstraněn. Signál nanočástic 60nm a větších byl dobře odlišený od signálu pozadí, u vzorku s obsahem 50nm částic již byl odstup signálu od šumu méně zřetelný.

Altium: Obrázek 5. Měření Si v režimu „On-Mass“

Vyhodnocením výsledků 1% etanolu a vzorku 50nm nanočástic byla zjištěna minimální měřitelná velikost částic (BED) na hodnotě 22nm, což svědčí o výborné citlivosti metody zejména díky perfektnímu odstranění interferencí CO⁺. Signály měření 1% etanolu (A), částic SiO₂ 50nm (B), 60nm (C) a 100nm (D) jsou seřazené v Obrázku 7, u 1% etanolu a 50nm částic navíc ještě doplněné o detail záznamu. Grafy distribuce velikostí částic vzorků 50nm (A), 60nm (B), 100nm (C) a 200nm (D) v 1% etanolu jsou ukázány na Obrázku 6.

V Tabulce 2 jsou shrnuté výsledky měření vzorků nanočástic v matrici 1% etanolu. Z naměřených dat byly velikosti částic pro srovnání vyhodnoceny jako medián, modus a aritmetický průměr naměřených hodnot. Ty se perfektně shodují mezi sebou i s referenčním měřením velikostí částic metodou Transmisní elektronové mikroskopie (TEM). Shoda výsledků je dobrým důkazem toho, že spolehlivé výsledky je možné získat již z 30 sekundové analýzy. Kromě velikostí částic byly u vzorků vyhodnoceny naměřené koncentrace Si ve formě částic v jednotkách ng/l. Jsou rovněž uvedeny v tabulce společně koncentracemi z přípravy vzorků. Na závěr byla měřena směs nanočástic 100nm a 200nm v prostředí 1% etanolu. Dle histogramu velikosti částic je patrné dobré rozlišení i dobrá přesnost stanovení velikostí ve směsném vzorku.

Tabulka 1. Podmínky měření nanočástic SiO₂ na ICP-QQQ 8900

Parameter / Value

• RF power / 1550 W

• Sampling depth / 7 mm

• Carrier gas / 0.76 L/min

• Sample uptake rate / 0.35 mL/min

• Spray chamber / temp. 2 °C

• Dwell time / 0.1 ms

• Settling time / 0 ms

• Acquired mass number / 28 for Q1 and Q2

• Cell gas / Hydrogen

• Cell gas fl ow rate / 2.0 mL/min (for water samples)

• Cell gas fl ow rate / 3.0 mL/min (for 1% ethanol samples)

Altium: Obrázek 6. Graf distribuce velikosti částic SiO2 50nm (A), 60nm (B), 100nm (C) a 200nm (D)

Altium: Obrázek 7. Signály měření demineralizované vody (A), částic SiO2 50nm (B), 60nm (C) a 100nm (D)

Altium: Tabulka 2. Výsledky měření velikosti a koncentrace nanočástic SiO2 v 1% roztoku etanolu.

Altium: Obrázek 8. Graf distribuce velikostí částic ve směsi 100nm a 200nm

Závěr

Je zřejmé, že problematice nanočástic, jejich vlastností a spolehlivému stanovení jejich obsahu v různých součástech životního prostředí bude v dalších letech věnována stále větší pozornost. ICP-QQQ 8900 Agilent Technologies je přesně tím nástrojem, který v sobě sdružuje schopnosti a možnosti potřebné pro měření nanočástic. Jsou to zejména robustnost, rychlost a bezkonkurenční citlivost měření doplněná o unikátní techniku efektivního odstranění maximálního množství interferencí.