UV-Vis analýza tepelné stability léčiv na bázi nukleových kyselin novým systémem analýzy Tm

Uživatelské výhody

• Snadné určení teploty, při které se 50 % dvouvláknových nukleových kyselin disociuje na jednovláknová (hodnota Tm).

• Automatizace žíhání (předúpravu) a analýzy hodnoty Tm pomocí průměrných a derivačních metod.

• Dosažení nejvyšší integrity dat v oboru při propojení se systémem LabSolutions™ DB/CS.

Analytická metoda

Léčiva na bázi nukleových kyselin jsou generickým termínem pro léky vyrobené z oligonukleových kyselin sestávajících z tuctu nebo více bází nukleové kyseliny nebo modifikované nukleové kyseliny spojené dohromady a vyrobené chemickou syntézou.

Léky na bázi nukleových kyselin byly v posledních letech aktivně vyvíjeny jako inovativní terapeutika nové generace, protože mohou cílit na molekuly, jako je mRNA, které konvenční nízkomolekulární léky a protilátkové léky nemohou.

Teplota tání (hodnota Tm), indikátor tepelné stability, hraje důležitou roli při vývoji léčiva na bázi nukleových kyselin a kontrole kvality.

Hodnota Tm je teplota, při které se 50 % dvouřetězcových nukleových kyselin disociuje na jednořetězcové a obecně platí, že čím vyšší je teplota, tím je tepelně stabilnější.

V této studii jsme provedli analýzu tepelné stability (Tm analýzu) nukleových kyselin pomocí UV-2600i UV-viditelného spektrofotometru a nového systému Tm analýzy.

Pomocí tohoto systému lze snadno vypočítat hodnotu Tm nukleových kyselin.

Shimadzu: Obrázek 1. UV - 2600i and 8-Series Thermoelectrically - Controlled Cell Holder

Systém analýzy Tm

Obrázek 1 vyobrazuje spektrofotometr UV -2600i and TMSPC-8i, ale také se může se jednat i o UV-1900i/2700i). Spektrofotometr obsahuje Tm analytický systém a Software LabSolutions UV-Vis Tm (Obrázek 2.)

Shimadzu: Obrázek 2. LabSolutions™ UV Vis Tm Software

Shimadzu: Obrázek 3. Postup měření Tm.jpg

Tm analýza je metoda analýzy, při které se zvyšuje teplota nukleových kyselin a změna absorbance (křivka tání) se měří pro stanovení hodnoty Tm.

Postup pro určení hodnoty Tm je (1) kontrola absorpce spektra, (2) žíhání vzorku, (3) měření křivky tání, a (4) provedení analýzy, jak je znázorněno na obr. 3.

Pomocí tohoto může být práce od žíhání (2) po analýzu (4). automatizovaná pomocí stejného softwaru, což výrazně zlepšuje účinnost. Navíc je správa dat snadná, protože absorpční spektrum (1), křivka tání (3), žíhání (2), a podmínky analýzy (4) jsou uloženy jako jeden soubor. Propojením tohoto systému se systémem Shimadzu LabSolutions DB/CS se vyzlepšuje integrita dat.

Analytická metoda

Tato studie použila jako vzorek primer nukleové kyseliny M13, připravený při 12 µM v pufru (17 mM NaCl, 10 mM fosfátový pufr).

Vzorkový roztok byl předem odplyněn, aby se zabránilo tvorbě vzduchových bublin během měření při vysoké teplotě.

Jsou dvě optické délky, 10 mm a 1 mm, které mohou být vybrány v závislosti na absorbanci (koncentraci) vzorku. a jsou k dispozici s vyhrazeným 8 - článkovým mikro multičlánkem.

V tomto experimentu byla použita cella s délkou optické dráhy 1 mm. Vzorky byly měřeny za podmínek uvedených v tabulce 1.

Tabulka 1. Podmínky měření

• Instrumentace: UV-2600i; TMSPC-8i

• Měřicí vlnová délka: 260 nm

• Měřicí vlnová délka (pro kalibraci): 320 nm

• Šířka štěrbiny: 2,0 nm

• Teplotní rozsah: 15 - 90 °C

• Rychlost akvizice: 1 °C

• Rychlost změny teploty: 1 °C/min

Obrázek 4. ukazuje okno nastavení parametrů. Chcete-li provést žíhání, nastavte teplotu na panelu (1). Klikněte na tlačítko „Nastavení“ pro teplotní program na panelu (2) a zadejte parametry, jako je počáteční a cílová teplota a čekací doba v okně teplotního programu na Obrázku 5. Toto okno umožňuje operátorovi simulovat teplotní program a kontrolovat, kolik času je potřeba. Pro automatickou analýzu hodnot Tm po měření lze metodu analýzy nastavit na panelu (3).

Shimadzu: Obrázek 4. Okno nastavení parametrů

Shimadzu: Obrázek 5. Okno nastavení programu teploty

Dostupné metody analýzy jsou metoda průměru, která určuje hodnotu Tm z průsečíku střední čáry tečny ke křivce tání, a metoda derivace, která určuje hodnotu Tm z maximální hodnoty první derivace.

Všechny zde nastavené podmínky lze uložit jako šablonu, čímž odpadá nutnost nastavovat podmínky příště znovu. Po nastavení parametrů může být celý proces, od žíhání až po měření a analýzu, proveden automaticky kliknutím na tlačítko „Tm Měření“.

Výsledky měření

Obrázek 6 ukazuje absorpční spektrum vzorku. Přepínání karet ((4) na obr. 6) umožňuje uživateli přepínat mezi absorpčním spektrem a křivkou tání a jejich kontrolu.

Shimadzu: Obrázek 6. Absorpční spektrum

Obr. 7 ukazuje křivky tání analyzované dvěma metodami, průměrnou metodou a metodou odvození, a Tabulka 2 ukazuje hodnoty Tm vypočítané pro obě analytické metody.

Shimadzu: Obrázek 7. Křivka tání

Tabulka 2 Výsledky měření vzorku

Metoda analýzy / Hodnota Tm (°C)

• Průměrná metoda / 65,47

• Derivační metoda / 65,98

Jak je uvedeno v Tabulce 2, hodnoty Tm získané oběma metodama jsou si velmi blízké.

Závěr

V této studii jsme provedli analýzu tepelné stability (Tm analýza) nukleových kyselin pomocí UV-2600i UV-Vis spektrofotometru a Tm analytického systému.

Tento systém dokáže efektivně vypočítat hodnotu Tm léků na bázi nukleové kyseliny a to snadno, protože proces od žíhání po analýzu může být proveden automaticky.

Očekává se, že tento systém, který zjednodušuje postup pro stanovení hodnot Tm, dramaticky urychlí vývoj léků na bázi nukleových kyselin.