Organická analýza - Nukleární magnetická rezonance

10.5 Nukleární magnetická rezonance

• 10.5.1 Princip metody

• 10.5.2 Instrumentace

• 10.5.3 Interpretace spekter

  • 10.5.3.1 Příklad interpretace 1D spekter
  • 10.5.3.2 Příklad interpretace 2D spekter

• 10.5.4 ¹⁵N NMR spektroskopie

• 10.5.5 Způsoby měření ¹⁵N NMR spekter v roztoku

  • 10.5.5.1 Přístrojové vybavení pro měření 15N NMR spekter
  • 10.5.5.2 Standardy v ¹⁵N NMR

• 10.5.6 Interpretace ¹⁵N NMR spekter

• 10.5.7 Speciální kvantitativní analýza

Kniha obsahuje přehled metod analýzy organických látek: Analytikům prohloubí jejich znalosti používaných metod a vedoucím pracovníkům poskytne podklady pro řešení úkolů jejich laboratoře. Je určena také pro studenty a vyučující univerzit a vědecké pracovníky.

💡 Kompletní obsah naleznete v odborné publikaci Organická analýza, kterou můžete zakoupit přímo u vydavatele 2 THETA, prostřednictvím LabRulez nebo v mnoha knihkupectvích.

Nukleární magnetická rezonance

Princip metody

Spektroskopie nukleární magnetické rezonance (NMR) představuje příklad propojení různých vědních oborů. Z pohledu fyziky jde o změnu orientace jaderného spinu v magnetickém poli, přičemž magnetické pole vytváří supravodivá cívka ochlazená na teplotu kapalného helia. Chemici a biochemici používají NMR pro studium struktury malých molekul až biomakromolekul. V lékařství se kromě dnes už běžného zobrazování měkkých tkání rozšiřuje i využití spektroskopie magnetické rezonance k detekci metabolitů přímo v živých tkáních. U spektroskopie NMR se stejně jako u dalších spektroskopických technik sleduje, jak při přechodu mezi energetickými hladinami dochází k absorpci či emisi záření o různých hodnotách energie. U spektroskopie NMR je ovšem na rozdíl od jiných technik nutnou podmínkou, aby byl vzorek umístěn v magnetickém poli a aby obsahoval magneticky aktivní jádra, tj. izotopy s nenulovým spinovým kvantovým číslem. Jsou to všechna jádra vyjma takových, která obsahují sudý počet protonů a zároveň sudý počet neutronů (např. ¹⁶O s 8 protony a 8 neutrony nebo C se 6 protony a 6 neutrony). U každého prvku existují izotopy, které podmínku nenulového spinu splňují, ne vždy jsou to ovšem izotopy s největším zastoupením. U nejčastěji měřeného prvku, vodíku, jsou měřitelné všechny tři izotopy (tedy jak převažující ¹H, tak deuterium i tritium). Ovšem u dalšího často běžně sledovaného prvku, uhlíku, je tedy izotop ¹²C s přirozeným výskytem 99 % neměřitelný a musí se měřit izotop ¹³C, jehož přirozené zastoupení je pouze 1 %.

Instrumentace

Pro vlastní měření se řádově miligramy pevné nebo kapalné látky rozpustí v deuterovaném rozpouštědle (chloroform, voda, dimethylsulfoxid aj.) a převede do NMR kyvety, což je skleněná zkumavka o průměru většinou 5 mm. Pro běžná měření není analyt třeba navažovat, ani není třeba přesně odměřovat objem rozpouštědla, který bývá kolem 0,5 ml.

Koncentrace látky určuje dobu potřebnou pro změření spektra s danou kvalitou (tj. pro daný poměr signálu k šumu). Platí totiž, že pro získání stejně kvalitního spektra je potřebný měřící čas nepřímo úměrný druhé mocnině koncentrace. Tak např. při poloviční koncentraci je tedy třeba čtyřnásobného času. Přitom měřící čas pro měření spekter ¹³C je řádově 10000-krát delší než pro měření vodíkových spekter. Měřící čas narůstá i u 2D spekter. Jelikož se jedná o látkovou koncentraci, závisí samozřejmě také na molekulové hmotnosti látky. I z 1 mg běžné organické látky o relativní molekulové hmotnosti kolem 500 lze na dnešních spektrometrech změřit základní spektra NMR.

Interpretace spekter

Magnetické pole, kterému je vystaveno dané jádro atomu, je hlavně dáno konstantním vnějším magnetickým polem vytvářeným supravodivou cívkou přístroje. Kromě něj však působí na atomy též magnetická pole vyvolaná vazebnými elektrony a dále magnetická pole okolních jader. Magnetická pole okolních vazebných elektronů a okolních jader mají sice podstatně menší velikost než vnější magnetické pole, ale jsou obecně různá pro různé atomy v molekule. Výsledkem je, že celkové magnetické pole, kterému jsou vystaveny jednotlivé atomy, se poněkud liší. Tím pádem se poněkud liší i energetický rozdíl mezi hladinami jaderných spinů, a tedy i odpovídající hodnoty energie. Tyto velmi malé změny hodnoty absorbované energie se ve spektroskopii NMR sledují. Různě prostorově uspořádaným atomům v molekule pak odpovídají různé signály ve spektru a naopak: každý signál ve spektru odpovídá jednomu či více atomům v molekule, které jsou stejně uspořádané, tj. zaměnitelné v rámci molekuly.

Tak např. v molekule benzenu je všech šest atomů vodíku stejných, všechny jsou vystaveny stejným vlivům okolních vazeb a okolních atomů čili stejnému celkovému magnetickému poli. Stejná je i energie odpovídající změně orientace jaderných spinů v magnetickém poli a všech šest atomů vodíku dává tedy jediný signál ve vodíkovém spektru. Totéž platí pro šest atomů uhlíku v molekule benzenu. V molekule acetonu je vlivem rychlé rotace methylových skupin navzájem zaměnitelných všech šest atomů vodíku, zatímco ze tří uhlíkových atomů jsou stejné pouze dva uhlíky v methylových skupinách a uhlík karbonylu se od nich liší. Vzhled spektra NMR lze na základě struktury a symetrie molekuly předpovědět. Nejen počet signálů, např. jediný signál ve vodíkovém spektru acetonu a dva signály v uhlíkovém spektru acetonu, ale také pozici signálů, neboť ta se liší pro signály alifatické, aromatické a je ovlivněna sousedícími atomy. Intenzita signálů odpovídá zase počtům atomů s daným uspořádáním. Signály ve vodíkovém spektru vykazují navíc běžně tzv. multiplicitu, která souvisí s tím, jak jsou uspořádány vodíky na sousedních atomech. Interpretace spektra potom spočívá v tom, že se signály ve spektru zpětně přiřazují atomům v molekule s ohledem na typ okolních vazeb a na sousedící atomy, až se dostane propojení všech atomů, tedy konstituce molekuly. Jednodušší je situace, kdy se jedná o ověření struktury předem známé látky.

Vzhled spektra NMR lze na základě struktury a symetrie molekuly předpovědět. Nejen počet signálů, např. jediný signál ve vodíkovém spektru acetonu a dva signály v uhlíkovém spektru acetonu, ale také pozici signálů, neboť ta se liší pro signály alifatické, aromatické a je ovlivněna sousedícími atomy. Intenzita signálů odpovídá zase počtům atomů s daným uspořádáním. Signály ve vodíkovém spektru vykazují navíc běžně tzv. multiplicitu, která souvisí s tím, jak jsou uspořádány vodíky na sousedních atomech.

Příklad interpretace 1D spekter

Postup interpretace spektra neznámé látky bude ukázán na následujícím Obr.

2 THETA: Obr. Protonové (vodíkové) spektrum NMR

Co se z něj dá vyčíst? Ve spektru je vidět celkem pět signálů (tj. uskupení jedné či více linií) v různých pozicích na vodorovné ose. Veličinou na vodorovné ose je tzv. chemický posun (sigma). Je to relativní změna rezonanční frekvence signálu oproti rezonanční frekvenci standardu. Tato změna je číslo řádu 10¯⁶ (zkratkou ppm) - tak relativně málo se totiž liší magnetická pole, která působí na jednotlivá jádra. Typické hodnoty chemických posunů atomů ¹H a ¹³C uvádí následující tabulka.

2 THETA: Obr. Hodnoty chemických posunů jader ¹H a ¹³C

Příklad interpretace 2D spekter

Ke kompletnímu přiřazení signálů ve vodíkovém a uhlíkovém spektru atomům ve struktuře molekuly je třeba informace ze spekter 1D doplnit i informacemi z dvoudimenzionálních (2D) spekter.

2 THETA: Obr. Příklad interpretace 2D spekter

Uvedená látka obsahuje z pohledu NMR šest navzájem různých skupin CH₂ (1 až 6), skupinu OH, COOH (8) a pak další kvartérní uhlík COO (7). Tato molekula není symetrická, takže ve vodíkovém i uhlíkovém spektru očekáváme šest různých signálů skupin CH₂, k tomu ve vodíkovém spektru signály OH a COOH. V uhlíkovém spektru pak očekáváme kromě šesti signálů pro skupiny CH₂ ještě další signály pro uhlíky ze skupin COO a COOH.

2 THETA: Obr. ¹H NRM-spektrum

2 THETA: Obr. Alifatická část ¹H NRM-spektra

2 THETA: Obr. ¹³C NMR-spektrum

Vodíky ze skupiny OH a COOH jsou u 7 ppm ve vodíkovém spektru vidět v jediném širokém signálu. Fakt, že hlavně signály skupin OH bývají v důsledku disociace a chemické výměny rozšířeny, někdy až tak, že nejsou vůbec pozorovatelné, je naprosto běžný a při interpretaci spekter NMR se s tím počítá. Jednotlivé dvojice vodíků ze čtyř skupin CH₂O dávají čtyři signály v oblasti 3,5-4,5 ppm, každý s integrální intenzitou 2. U 2,5 ppm je pak vidět signál s intenzitou 4 náležející vodíkům ze dvou různých skupin CH₂CO, které jsou si
strukturně v rámci molekuly hodně blízké, takže jejich signály splynuly do jednoho. Signál bez údaje o integrální intenzitě nejvíce vlevo náleží zbytkovému vodíku z použitého deuterovaného rozpouštědla CDCl₃.

Vedle vodíkového a uhlíkového spektra máme k dispozici také tři základní 2D spektra, a sice:

1. homokorelované spektrum (COSY), které obsahuje informaci o interakci atomů vodíku na sousedních uhlících

2. heterokorelované (HSQC) spektrum s interakcemi vodíků přímo vázaných na jednotlivých uhlících (prostřednictvím 1J( ¹³C a ¹H ))

3. heterokorelované spektrum s korelacemi na větší vzdálenost (HMBC)

Dvoudimenzionální spektra vypadají jako grafy x-y, kde na ose x je zobrazeno vodíkové spektrum a na ose y buď opět spektrum vodíkové (u COSY), nebo spektrum uhlíkové v případě HSQC a HMBC. Interakce jaderných spinů příslušejících daným atomům, je v grafu x-y zaznamenána jako signál (v hrubém přiblížení kolečko), jehož poloha na osách obou os odpovídá chemickým posunům interagujících jader neboli jejich signálům v jednodimenzionálních spektrech.

¹⁵N NMR spektroskopie

Dusík je velmi častým a významným atomem jak v anorganických, organických tak i v organokovových sloučeninách. Hraje velmi významnou roli v biologicky aktivních sloučeninách a biochemických procesech. Dusík se slučuje téměř se všemi prvky periodické tabulky prvků, přičemž existuje v oxidačních stavech –III, 0, I, II, III, IV a V, vytváří funkční skupiny s řádem vazby 1-3, je schopen vytvářet koordinační sloučeniny s koordinačním číslem 1-6, atd. Velkou většinu těchto vlastností je možné postihnout analýzou dusíkových NMR spekter. Dusík existuje v přirozeném zastoupení jako směs dvou izotopů: ¹⁴N a ¹⁵N.

Nukleární magnetická rezonance je ve srovnání s jinými spektrálními metodami málo citlivá, a tudíž relativní citlivost je důležitá při rozhodování, zda použijeme ke studiu vzorků ¹⁴N nebo ¹⁵N NMR spektroskopie. Ze srovnání relativní citlivosti vyplývá, že přednost by měla dostat ¹⁴N NMR spektroskopie, která je formálně přibližně třistakrát citlivější.

Způsoby měření ¹⁵N NMR spekter v roztoku

1. Přímá detekce: původní a základní způsob měření, který je velmi náročný na experimentální čas.

2. Techniky s přenosem polarizace (INEPT, DEPT): tyto techniky přinesly výrazné zkrácení doby měření ¹⁵N NMR spekter a) zvýšením citlivosti a b) skutečností, že dlouhé relaxační časy izotopu ¹⁵N byly nahrazeny mnohem kratšími relaxačními časy ¹H.

3. Nepřímá (protonová) detekce: nejvyšší možná citlivost, v současnosti nejpoužívanější způsob měření ¹⁵N NMR spekter.

Interpretace ¹⁵N NMR spekter

Rozsah ¹⁵N chemických posunů je výrazně větší než je tomu u ¹H (obvykle 25 ppm) a ¹³C chemických posunů (obvykle 250 ppm) a číselně vyjádřený dosahuje hodnot pro diamagnetické látky okolo 1000 ppm. Vezmeme-li v úvahu, že pološířky signálů w1/2 v ¹⁵N NMR spektru jsou obvykle menší než 0,05 ppm, je zjevné, že pomocí ¹⁵N NMR spekter je možné studovat velmi nepatrné změny ve struktuře látek. Navíc, ¹⁵N chemické posuny jednotlivých funkčních skupin jsou většinou od sebe dostatečně izolované.

Speciální kvantitativní analýza

Klasická kvantitativní analýza, jak ji známe z použití u ¹H, resp. ¹³C NMR spekter, tj. integrace signálů s cílem využít relativní integrální intenzity, je u izotopu ¹⁵N prakticky nepoužitelná, protože relaxační mechanismy jsou v případě izotopu ¹⁵N velmi složité a záporná hodnota gyromagnetického poměru γ situaci rovněž komplikuje.

Závěr

Z následujícího seznamu literatury je zjevné, že literární odkazy týkající se ¹⁵N NMR spekter jsou poměrně staršího data, protože novější prakticky neexistují. Je to dáno tím, že v minulosti se měřením ¹⁵N NMR spekter zabývali zejména specialisté. Opačný trend je pozorovatelný v případě, kdy se zaměříme na počet publikovaných prací. Tam zjistíme obrovský nárůst počtu publikací v posledních letech, který je dán zvýšením citlivosti a dostupnosti NMR spektrometrů. Měření ¹⁵N NMR spekter se stává rutinní záležitostí. Domnívám se, že ¹⁵N NMR spektra najdou uplatnění zejména v případech, kdy jejich prostřednictvím můžeme získat originální výsledky a údaje, které jsou nedostupné pomocí jiných spektrálních metod, které tak ospravedlní obvykle výrazně větší časové nároky na jejich získání oproti mnohem rutinnějším a častěji používaným ¹H a ¹³C NMR spektrům.