Cytosolová exprese Zeleného fluorescenčního proteinu (GFP) a jeho derivátů v kvasinkách Saccharomyces cerevisiae

Od roku 1994 kdy poprvé Chalfie s jeho kolegy provedl izolaci, se stal Zelený fluorescenční protein (GFP) nesmírně populárním a výkonným nástrojem pro neinvazivní sledování buněčných procesů in vivo. GFP je protein složený z 238 aminokyselin, který se izoluje z medúzy Aequorea victoria. Protein má elegantní strukturu β-barelu o velikosti 30 x 40 Å, která chrání vnitřní tripeptidový fluorofor (Obrázek 1).

Altium International: Obrázek 1. Schématické zobrazení zeleného fluorescenčního proteinu. Červeně je zobrazen tripeptidový fluorofor

Po excitaci světlem při 395 nm nebo 475 nm fluorofor GFP emituje jasnou zelenou fluorescenci při 509 nm. Tento jev může být detekován použitím různých instrumentů – jako je fluorescenční mikroskop, fluorescenční průtokový cytometr a fluorimetr.

GFP je vysoce atraktivní nástroj pro dnešní vědce v oborech „life science“, hlavně protože protein nepotřebuje další substráty a kofaktory pro dosažení funkční struktury proteinu. Díky tomu je možná exprese GFP v oblasti živých organismů a buněčných systémů, což má za následek maturaci a fluorescenční signál. Jinými slovy GFP umožňuje buňkám produkovat jejich vlastní fluorescenční marker.

Díky tomu je pak možné obejít použití konvenčních fluorescenčních zobrazovacích postupů, při kterých dochází často k toxickému ovlivnění buněk a nelze tak obecně provádět studie in vivo. GFP dovoluje studie buněčných procesů v reálném čase v živých buňkách, intaktních buňkách a organismech, které umožňují lepší porozumění biologickým mechanismům ve fyziologických modelech.

Jedna z prvních aplikací GFP bylo využití GFP jako reportéru genové exprese a proteinové lokalizace. GFP byl použit k vizualizaci buněčných organel, cytoskeletonu a sekreční dráhy. Od té doby se již výrazně rozrostly aplikace GFP a jeho derivátů, které byly vyvinuty.

Mutační studie chromoforů a okolních aminokyselin vyprodukovaly nové deriváty GFP s odlišnými excitačními a emisními spektry. Těmito deriváty jsou modrý (BFP), tyrkysový (CFP) a žlutý (YFP) fluorescenční protein. Všechny tyto barevné proteiny mají vylepšené maturační hodnoty a fluorescenční intenzity. Barevné spektrum bylo nedávno rozšířeno Matzem a jeho spolupracovníky, kteří izolovali červený fluorescenční protein z Discosomy coral (dsRed), s 30% sekvenční homologií s Aequorií GFP. Tato široká škála spektrálně odlišných fluorescenčních proteinů poskytuje rozeznatelné markery pro simultánní studie vícenásobných buněčných procesů, stejně jako umožňuje pokročilejší aplikace. Příkladem může být studie interakcí protein-protein s použitím jevu fluorescenčního rezonančního přenosu energie (FRET).

Fluorescenční vlastnosti rodiny GFP jsou odlišné v případě spektrálního profilu, intenzity a citlivosti vůči stabilitě signálu. Proto je důležité optimalizovat detekční a měřící protokoly pro GFP a jeho deriváty ještě před experimentální analýzou v každém experimentálním modelu. Prezentovaná studie má za cíl detekovat a charakterizovat GFP exprimované v cytosolu živých kvasinkových buněk (Saccharomyces cerevisiae) s použitím fluorescenčního spektrofotometru Agilent Cary Eclipse.

Materiál a metody

Vybavení:

• Agilent Cary Eclipse fluorescenční spektrofotometr
• Vícekyvetový držák s Peltierovým chlazením a elektromagnetickým mícháním
• Teplotní kontrolér
• Teplotní sondy
• Magnetická míchadélka
• Křemenné kyvety

Kmeny kvasinek

YRD15 (MATα, his3, ura3, leu2,p+) kvasinek S. cerevisiae byl mateřský kmen použitý v této studii. Geny kódující GFP deriváty (žlutý, zelený, modrý, tyrkysový) a červený fluorescenční protein (DsRED) byly klonovány do kvasinkového expresního plasmidu pAS1N a transformovány do kvasinkového kmene YRD15, který je popsán výše. Transformované buňky byly naneseny na kvasinkové minimální médium (0,75% kvasinkové minimální médium bez aminokyselin, 2% glukóza, 1,5% agar) se selektivními markery kultivované 3 až 5 dnů při teplotě 28 °C.

Postup

Kvasinky byly dvakrát promyty v 1 ml MiliQ vody, aby byla odstraněna kontaminující média, poté byly resuspendovány v MiliQ vodě na konečnou optickou hustotu 0,55 Abs při 650 nm. Buněčné suspenze (2ml) byly umístěny do jednorázových fluorescenčních kyvet (Sarstedt) a do vícekyvetového držáku, který byl umístěn do vzorkovacího prostoru Cary Eclipse fluorescenčního spektrofotometru. Teplota v kyvetách byla nastavena na 25 °C. S použitím SW modulu „Scan“ byla buněčná suspenze excitována světlem náležité vlnové délky pro každý specifický fluorescenční protein (viz webová stránka Clontech – komplexní list excitačních/emisních maxim fluorescenčních proteinů). Emisní skeny byly zaznamenány pro GFP, BFP, CFP, YFP a DsRed. Parametry měření skenů DsRed jsou uvedeny v Obrázku 2.

Altium International: Obrázek 2. Instrumentální parametry pro detekci emisního spektra DsRed (emisní maximum 583 nm) a excitace 55O nm (excitace 558 nm)

Výsledky a diskuze

Emisní spektra všech fluorescenčních proteinů jsou znázorněna na Obrázku 3.

Altium International: Obrázek 3. Intenzita vs. emise fluorescenčních proteinů pro celé spektrum

Spektra všech fluorescenčních proteinů, jejichž exprese probíhala v cytosolu kvasinkových buněk, byla snadno zaznamenána a spektra korespondují s očekávanými charakteristikami. Šum, produkovaný buněčnou autofuorescencí, a rozptyl byly zanedbatelné, zejména v důsledku použití vnitřních filtrů, kterými je vybaven jak emisní tak i excitační monochromátor v Agilent Cary Eclipse. Snížení autofluorescence (buď zkoumaného vzorku nebo média) je nesmírně důležité při použití fluorescenčních proteinů, které mají buď nízkou intenzitu fluorescence, nebo jsou excitovány vysoce energetickým UV zářením (jako například BFP). UV záření iniciuje silné fluorescenční odezvy z mnoha složek buněčné prostředí a musí být minimalizovány, aby se zabránilo maskování emise z cílových fluorescenčních proteinů, zejména když se sledují drobné interakce proteinů.

Závěr

Agilent Cary Eclipse s vícekyvetovým držákem a příslušenstvím pro teplotní kontrolu poskytuje jednoduché, rychlé a reprodukovatelné řešení pro měření a charakterizaci různých fluorescenčních proteinů exprimovaných v celých buňkách. Nyní existuje příležitost specificky označit proteiny zájmu uvnitř buněk pomocí různých GFP a sledovat tak interakce současně pomocí měření při několika vlnových délkách – to umožňuje automatickou excitaci a odečítání emise až pro šest různých fluorescenčních sond in vivo.

Agilent Cary Eclipse fluorescenční spektrofotometr

Cary Eclipse fluorescenční spektrofotometr nabízí vysoký výkon, jež můžete očekávat jen od Cary. S technologií zábleskové xenonové výbojky, elektronikou "plug-and-identify" a funkcemi nabitým intuitivním softwarem, ztělesňuje tento přístroj jméno Cary. Přístroje našly své uplatnění v mnoha rutinních laboratořích po celém světě, kde je nezbytná jejich spolehlivost a snadné použití.

Altium International: Agilent Cary Eclipse fluorescenční spektrofotometr