Čeští vědci jako první zobrazili povrchovou strukturu chromozomu – díky inovaci elektronové mikroskopie

Jako první na světě zobrazili celý chromozom v přirozeném stavu. Vědci z Ústavu přístrojové techniky AV ČR a Ústavu experimentální botaniky AV ČR věří, že jejich revoluční odhalení miniaturních výběžků s prostorově uspořádanými smyčkami vláken na povrchu chromozomu může mít využití v medicíně či zemědělství.

Vědavýzkum.cz / ÚPT AV ČR: kolorovaný snímek chromozomu v nativním stavu získaný pomocí nově vyvinuté pokročilé environmentální rastrovací elektronové mikroskopie.

Po letech bádání a pokusů světových laboratoří, jak zobrazit biologické vzorky v přirozeném stavu, přišli čeští vědci s řešením. Vylepšili metodu environmentální elektronové mikroskopie, kterou nazvali A-ESEM. Podle autora metody Viléma Neděly, vedoucího brněnského týmu Environmentální elektronové mikroskopie Ústavu přístrojové techniky AV ČR (ÚPT), tato inovace otevírá zcela nové možnosti zkoumání jak neživé, tak především živé hmoty. Metoda A-ESEM neboli pokročilá environmentální rastrovací elektronová mikroskopie (A-ESEM; Advanced Environmental Scanning Electron Microscopy) totiž umožní zkoumat prakticky všechny živé vzorky: rostlinné a částečně i živočišné buňky v přirozeném stavu, malé živé živočichy, houby, plísně, roztoče, proteiny, bakterie, a vědci se chystají i na viry. Na vývoji metody spolupracoval s Evou Tihlaříkovou.

Vědavýzkum.cz: Vilém Neděla a Eva Tihlaříková u svého A-ESEM mikroskopu.

A-ESEM je podle Viléma Neděly ze všech elektronově mikroskopických metod nejvíce univerzální, navíc ji lze použít k přípravě a dalším fyzikálně-chemickým analýzám vzorků. Je rychlejší, levnější a vhodnější pro studium dynamických změn biologických vzorků než kryo-elektronová mikroskopie, oceněná v roce 2017 Nobelovou cenou. „Tato nová metoda řeší základní problém zdánlivé neslučitelnosti elektronové mikroskopie s přítomností vody v kapalném skupenství ve vzorku. Proto je vhodná pro zobrazování živých organismů a extrémně citlivých nanostruktur a nanopovrchů ve vysokém rozlišení,“ říká Vilém Neděla.

Dosud se pro zobrazení prostorové struktury biologických i nebiologických materiálů s rozlišením až miliontiny milimetru používala primárně rastrovací elektronová mikroskopie (SEM), při které se vzorky pozorují ve vysokém vakuu. Proto musejí projít úpravami jako je např. pokovení, vysušení, chemická fixace či zmražení, jež ale mohou poškodit jejich strukturu. A to vylučuje jejich pozorování v nativním stavu, na rozdíl od environmentální elektronové mikroskopie. „Environmentální elektronová mikroskopie byla vyvinuta v 80. letech, byla však dlouho neoptimalizovaná, měla špatné rozlišení, špatný signál, šum. My jsme do přístroje provedli několik zásahů, kterými si myslím, že tuto metodu dokážeme znovuzrodit," myslí si Vilém Neděla.

„Využíváme softwary s umělou inteligencí, které poradí, jak nastavit parametry jako je například vlhkost či proudění, aby se vzorek nezničil. Využili jsme mnoha vlastních inovací a díky ultracitlivým detektorům pozorujeme vzorky ve vysokém tlaku plynu a ve vlhkosti až 100 %, tedy v enviromentálně kompatibilních podmínkách – velice šetrně, neubližujeme jim,“ popisuje Vilém Neděla.

Vědavýzkum.cz: Prototyp unikátního elektronového mikroskopu pro realizaci metody A-ESEM.

Četné výběžky s neznámou funkcí a složením

Potenciál nové metody ověřili vědci ve spolupráci s olomouckým pracovištěm Ústavu experimentální botaniky AV ČR studiem chromozomů izolovaných z ječmene.

Chromozomy, v nichž je uložena dědičná informace, v průběhu dělení buněk kondenzují v mikroskopické válečkovité útvary (typický tvar písmene X). O odhalení jejich nanostruktury se léta pokoušely vědecké týmy z celého světa, kvůli nutné přípravě vzorku do elektronového mikroskopu však zobrazili pouze artefakty. Povrchová vrstva chromozomu je totiž extrémně citlivá, takže v důsledku ošetření chemikáliemi, pokovení či jiným použitým metodám byla buď poškozena či zcela odstraněna. Vědecká komunita se tak domnívala, že chromozomy jsou hladké.

„Teprve nově vyvinutá metoda A-ESEM odhalila, že povrch kondenzovaných chromozomů je posetý četnými výběžky, smyčkami chromatinových vláken o průměrné velikosti kolem 30 nm. Takové prostorové uspořádání povrchu chromozomů nebylo dosud pozorováno. Navíc je velmi pravděpodobné, že se nám podařilo zobrazit i nepatrné, jen 12 nm velké nukleozomy, na kterých je jako na cívky navinuta molekula DNA,“ doplňuje rostlinný genetik Jaroslav Doležel, vedoucí olomouckého týmu Ústavu experimentální botaniky AV ČR.

„Chromozomy jsem izoloval pomocí průtokové cytometrie, následně jsme měli jen 4 hodiny na to, abychom vzorek transportovali z Olomouce do Brna a zobrazili ho, poté totiž už chromozom degraduje. Ve vědě je důležité mít štěstí a já jsem ho měl," říká Jaroslav Doležel, který v roce 2018 obdržel Národní cenu vlády Česká hlava.

Získané výsledky přispívají k pochopení molekulární struktury mikroskopických útvarů – chromozomů, které přenášejí dědičnou informaci z rodičů na potomstvo. Zatímco u člověka jsou jejich poruchy příčinou dědičných chorob, u zemědělských plodin vedou ke snížené plodnosti a výnosu. Odhalení povrchové struktury chromozomů poskytuje nový pohled na strukturu dědičného aparátu, umožní identifikaci poruch v jeho uspořádání a přispěje k vývoji syntetických organismů s uměle vytvořenou dědičnou informací. „Nyní musíme zjistit, jaké složení a jakou funkci přesně mají tyto povrchové výběžky v perichromozomální vrstvě, které jsme zobrazili," říká Jaroslav Doležel.

Vědavýzkum.cz: Čeští vědci jako první zobrazili povrchovou strukturu chromozomu – díky inovaci elektronové mikroskopie.

Uplatnění nové metody

Zobrazení nanorozměrných povrchových struktur vyžadovalo velmi vysoké rozlišení. Dosažitelné rozlišení A-ESEM je, při podmínkách studia chromozomů, srovnatelné s rozlišením klasického „vakuového“ rastrovacího elektronového mikroskopu (SEM) – kolem 4 nm, což může mít podle Viléma Neděly zcela zásadní vliv na vývoj světového trhu s elektronovými mikroskopy. Zprvu prý jejich výsledkům nechtěla světová komunita ani uvěřit. Pro oponenty publikace ověřovali rozlišení na nanočásticích zlata o velikosti 5 nm, vložených do tabáku.

„Možnost spojení A-ESEM s dalšími zobrazovacími technikami, včetně světelné mikroskopie, umožní vědcům zobrazování a funkční analýzu nejen chromozomů, ale i dalších biologických objektů v přirozeném stavu. Jaké praktické dopady bude případné široké nasazení nové metody A-ESEM mít, v tuto chvíli není možné ani odhadnout. V Ústavu přístrojové techniky Akademie věd ČR jsme každopádně přesvědčeni, že jde o jeden z nejdůležitějších objevů, které byly učiněny na půdě naší instituce, a je revolučním krokem vpřed pro elektronovou mikroskopii jako takovou,“ myslí si Vilém Neděla.

Na dalším rozvoji metody spolupracuje s firmou NUM solution. „Náš objev stojí na třech pilířích, pro které jsme vytvořili prototypy – chlazený držák, speciální elektronika, která tento držák ovládá, a software s umělou inteligencí. Máme také patentovaný speciální detektor. Tyto inovace představují dost zásahů do přístroje, které nejsou levné. Na další rozvoj do komerční podoby jsme obdrželi podporu PRAK od Akademie věd. Pokud budeme úspěšní, mohlo by to vyústit až do založení spin-off firmy," říká Neděla.

„Aby se tento inovovaný přístroj environmentální elektronové mikroskopie dostal na trh, je třeba spolupracovat ještě na dalších problematikách a ukázkách možného využití, o což se nyní pan Neděla snaží," říká Ilona Müllerová, místopředsedkyně Akademické rady AV ČR a bývalá ředitelka Ústavu přístrojové techniky AV ČR.

Výsledky mnohaletého výzkumu brněnských a olomouckých vědců publikoval časopis Scientific Reports, který je součástí nakladatelství vydávajícího jeden ze světově nejprestižnějších vědeckých časopisů Nature.