25. Škola MS 2024 - den 4

4. den 25. Školy MS byl zaměřený na lipidomiku a své prezentační a odborné znalosti nám představili mladí nadějní analytici z oblasti hmotnostní spektrometrie. Vidělli jsme 16 odborných přednášek ve 4 blocích.

Ranní sekce přinesla 2 komplexní přednášky popisující pokročilé MS techniky, iotovou mobilitu a jejich využití v praxi. Následovala úvodní přednáška do světa lipidomiky.

Druhý blok se věnoval cílené lipidomice, metodám a využití v klinických analýzách nebo MS zobrazování lipidů. Závěrečná přednáška bloku představila nejnovější technologie v oblasti GCxGX TOF MS instrumentace.

Tématem odpolední sekce byla necílená lipidomika, její metody a využití bioinformatických nástrojů a biostatistiky v lipidomické analýze.

Závěrečná sekce s názvem MLÁDÍ VPŘED nám ukázala, jak šikovné a kvalitní talenty v našem oboru máme a setkala se velice pozitivním ohlasem. 6 přednášek o délce 15 min představilo témata jako:

• Využití LLE-GC-[EI]-ORBITRAP MS v oblasti expozice lidí škodlivým látkám
• Jak mapovat rostlinné hormony
• Multiomický přístup při řešení zdravotních problémů s idiopatickými střevními záněty
• Využití UHPLC MS/MS v monitoringu nových psychoaktivních látek
• MS při studiu vlivu funkčních skupin u peptidových iontů v plynné fázi
• Přípravu vzorků z pohledu extrakce a purifikace u rostlinných materiálů

Závěrečná technický přednáška nám ukázala nejnovější technologie v oblasti LC/HRMS TOF systémů.

ČTVRTEK 12. září 2024

ZÁKLADY HMOTNOSTNÍ SPETROMETRIE A OMIK III

• Předsedající: Ondřej Novák

8:30 – 9:15 Základy hmotnostní spektrometrie – Pokročilé MS instrumentace, iontová mobilita a jejich reálné využití

• Patrik Španěl

SSJMM: Základy hmotnostní spektrometrie – Pokročilé MS instrumentace, iontová mobilita a jejich reálné využití (Patrik Španěl)

9:15 – 10:00 Úvod do lipidomiky

• Aleš Kvasnička

SSJMM: Úvod do lipidomiky (Aleš Kvasnička)

10:00 – 10:30 Přestávka na kávu

SEKCE VII. CÍLENÁ LIPIDOMIKA

• Předsedající: Patrik Španěl

10:30 – 11:00 Metody cílené lipidomiky

• Robert Jirásko

SSJMM: Metody cílené lipidomiky (Robert Jirásko)

11:00 – 11:30 Lipidomika v medicíně

• David Friedecký

11:30 – 11:50 Hmotnostně spektrometrické zobrazování distribuce lipidů

• Vladimír Vrkoslav

SSJMM: Hmotnostně spektrometrické zobrazování distribuce lipidů (Vladimír Vrkoslav)

11:50 – 12:05 Pegasus BTX – nový rodinný přírůstek firmy LECO na poli GC(xGC) TOF MS

• Pavel Jiroš (LECO)

SSJMM: Pegasus BTX – nový rodinný přírůstek firmy LECO na poli GC(xGC) TOF MS (Pavel Jiroš (LECO))

12:05 – 14:00 Oběd

13:30 – 14:30 Plakátová sdělení (sudá čísla)

SSJMM: Plakátová sdělení 25. Škola MS

SEKCE VIII. NECÍLENÁ LIPIDOMIKA

• Předsedající: Aleš Kvasnička

14:30 – 15:00 Metody necílené lipidomiky

• Lukáš Najdekr

SSJMM: Metody necílené lipidomiky (Lukáš Najdekr)

15:00 – 15:30 Bioinformatické nástroje pro lipidomickou analýzu

• Michaela Vondráčková

SSJMM: Bioinformatické nástroje pro lipidomickou analýzu (Michaela Vondráčková)

15:30 – 16:00 Biostatistics in Lipidomics

• Jakub Idkowiak

SSJMM: Biostatistics in Lipidomics (Jakub Idkowiak)

16:00 – 16:30 Přestávka na kávu

SEKCE IX. MLÁDÍ VPŘED

• Předsedající: Petra Krejčí
• Kompletní abstrakty přednášek sekce MLÁDÍ VPŘED

16:30 – 18:00 6x 15 min (vč. diskuze)

16:30 – 16:45 Demonstrating Scalable Analysis of the Human Chemical Exposome by Automated LLE-GC-[EI]-ORBITRAP MS

• Kateřina Coufalíková

Measuring chemical exposure in large-scales studies is analytically challenging in term of robustness and reproducibility, as well as laboriousness of the entire procedure. Manual sample preparation is time consuming, requires high solvent consumption and contributes to sample-to-sample variation. Sequential on-line sample preparation offers a solution, but throughput is currently lacking in routine application. We have developed a fully automated sample preparation workflow coupled to gas chromatography – electron ionization – Orbitrap mass spectrometry (GC-[EI]-Orbitrap MS) for large-scale screening of chemical exposure agents in blood.

Within the framework of the ATHLETE (Advancing Tools for Human Early Lifecourse Exposome Research and Translation) project, the developed method has been applied to 754 adolescents of the Human Early Life Exposome (HELIX) cohort. Prior to instrumental analysis, plasma (100 μL) underwent sequential liquid-liquid extraction (LLE) via TriPlus RSH autosampler and extract injected (6 μL) on-line to programmable-temperature vaporizing (PTV) injector. LLE comprised addition of formic acid and isooctane containing deuterated internal standards to plasma, with vortexing (3 min, 1200 rpm) and centrifugation (3 min, 4800 rpm) for efficient mixing and extract separation. Analytes were separated on a 5-type column with 15-minute temperature gradient and mass spectra were recorded from 70-700 m/z at 60,000 resolving power. Quality assurance and quality control included the analysis of certified mixtures of alkanes and polychlorinated biphenyls, alongside the standard reference materials (SRM) materials NIST 1950, NIST 1957, NIST 1958 in each analytical batch.

QA/QC data were processed via targeted data processing using Skyline for small molecules. Selective ion integrations shows that batches show acceptable quality for future untargeted data processing. Average relative standard deviations (RSD) of peak areas for spiked D7 cholesterol and respective endogenous analyte are 25 % and 23 %, respectively. Retention time drift of 29 polychlorinated biphenyls measured in NIST SRM 1958 material bookending analytical batches 2-20 was 0.08 – 0.14 minutes. Deviation in accurate mass measurement for polybrominated diphenyl ether 28 and polybrominated diphenyl ether 153, representing ions at upper and lower end of m/z channel were in range 1.9 – (-2.2) ppm; 2.8 – (-3.3) ppm, respectively. The evaluated performance of the analysis assay and untargeted identification results will be presented.

SSJMM: Demonstrating Scalable Analysis of the Human Chemical Exposome by Automated LLE-GC-[EI]-ORBITRAP MS (Kateřina Coufalíková)

16:45 – 17:00 Mapování distribuce rostlinných hormonů na (sub)buněčné úrovni

• Jakub Lemberk

Rostlinné hormony neboli fytohormony jsou přirozeně se vyskytující organické sloučeniny, které působí jako bioaktivní signální molekuly a mají významný vliv na fyziologické procesy a vývoj rostlin. Hrají stěžejní roli v adaptaci rostlin na stres a měnící se podmínky prostředí. Velmi nízká koncentrace, v níž se fytohormony vyskytují, představuje pro jejich přímou analýzu a kvantifikaci překážku, kterou se podařilo překonat až díky nedávnému pokroku v hmotnostní spektrometrii a purifikačních technik. Naše znalosti o dynamickém rozložení fytohormonů na subcelulární úrovni však stále zůstávají neúplné. Z těchto důvodů je důležité vyvinout nové metodologické přístupy, které by nám umožnili zlepšit výsledky subcelulární frakcionace a izolace.

V tomto výzkumu byla vyvinuta metoda simultánního třídění a izolace organel z celých rostlin modelové rostliny Arabidopsis thaliana za využití fluorescenčně aktivovaného průtokového cytometru (FACS) a vybraných specifických fluorochromů. K určení obohacenosti frakcí o jednotlivé organely byla provedena genealogická analýza pomocí hmotností spektrometrie.

Dále byl FACS využit k třídění protoplastů získaných z fluorescenčně značených buněčných populací kořenové špičky A. thaliana. Natříděné protoplasty byly obarveny fluorochromy pro jednotlivé organely a opětovně sortovány. Tento krok je ovšem nutné ještě optimalizovat, např. eliminovat ztráty mezi tříděními, nebo zajistit rovnoměrnou homogenizaci protoplastů.

Cílem této práce je z nasbíraných „dvojitě-natříděných“ frakcí extrahovat a kvantifikovat metabolické profily fytohormonů pomocí kapalinové chromatografie ve spojení s hmotností spektrometrií (LC-MS/MS) a sestrojit mapu distribuce fytohormonů na úrovni organel v kořenové špičce A. thaliana. Poznatky by pomohly objasnit metabolom a (sub)buněčný transport fytohormonů a prohloubit naše porozumění vztahu rostlinných hormonů se souvisejícími buněčnými procesy.

SSJMM: Mapování distribuce rostlinných hormonů na (sub)buněčné úrovni (Jakub Lemberk)

17:00 – 17:15 Multiomický přístup pro diagnózu a monitoring léčby u pediatrických pacientů trpících idiopatickými střevními záněty

• Jakub Rozhon

Úvod: Chronická onemocnění projevující se opakovanými záněty gastrointestinálního traktu (GIT) jsou známá pod názvem idiopatické střevní onemocnění (angl.: inflammatory bowel disease; IBD). Hlavními podtypy IBD jsou ulcerózní kolitida (UC) a Crohnova choroba (CD). UC je charakterizována zánětem žaludeční sliznice postihujícím celé tlusté střevo nebo jeho část. Naproti tomu CD je charakterizována zánětlivým lézemi v rámci celého GIT. Standardní monitorovací postupy, jako je například detekce kalprotektinu ve stolici, poskytují nižší citlivost a vysokou variabilitu mezi vzorky pacientů. Proto byl v rámci této studie zvolen multiomický přístup analýzy vzorků zahrnující charakteristické změny v lipidomu a proteomu dětských pacientů trpících UC a CD v porovnání se zdravými kontrolami s cílem najít změny související s těmito onemocněními.

Metody: Byla provedena lipidomická analýza séra dětských pacientů trpících UC (n = 31), CD (n = 43) a zdravých kontrol (n = 27). Analýza byla provedena pomocí HPLC-MS/MS na přístrojích Exion LC (Sciex) a QTRAP 6500+ (Sciex). Separace více než 700 lipdů v rámci 20+ lipidových tříd proběhla na koloně BEH C8 (2.1 mm, 100 mm, 1.7 μm, Waters). Proteomická analýza byla provedena ze sér vybraných UC (n = 7), CD (n = 8) a kontrolních (n = 11) pacientů za pomocí spojení kapilární kapalinové chromatografie (Ultimate 3000 RSLCnano, Thermo Scientific) s tandemovou hmotnostní spektrometrií (Bruker Daltonics TimsTOF Pro 2), přičemž bylo detekováno celkem 151 protienů a peptidů. Výsledky byly vyhodnoceny pomocí univariantních a multivariantních statistických metod. 

Výsledky: Multivariantní analýza pomocí analýzy hlavních komponent lipidomu IBD pacientů odhalila jejich částečnou separaci od zdravých kontrol. V séru CD pacientů bylo pozorováno systematické snížení hladiny fosfatidylcholinových plasmalogenů a sfingomyelinů. Dále byla u všech IBD pacientů pozorována významně zvýšená hladina kyseliny dokosahexaenové (DHA či FA 22:6) ve srovnání s kontrolami. Proteom IBD pacientů odhalil buněčné odpovědi organismu na zánět, a to prostřednictvím proteinů akutní fáze (SHBG, α2-makroglobulin, inhibitor inter-α-trypsinu), koagulačních faktorů (FXII, plasminogen, protein S, kallikrein, anitrombin III, angiotensinogen a jiné), proteinových reaktantů v rámci imunity (C1, C2, faktor H komplementu, IgA1, IgA2, IgG2, IgG3, κ-variabilní řetězce imunoglobulinů a další) a antioxidativního systému (cerruloplasmin, AMBP) a také proteinů spojených s transportem a metabolismem lipidů (ApoCI, ApoCII, ApoCIII, ApoAII, ApoM, ApoE atd).

Závěr: Systematické změny v lipidomu a proteomu poukazují na souvislost s chronickými zánětlivými procesy, přičemž u CD pacientů byly tyto změny závažnější, což podporují i klinické údaje. Na základě této studie by mohla být důkladněji prozkoumána míra celkové patologie IBD onemocnění a efektivita procesu jeho léčby, ať už konzervativního, či biologického původu.

SSJMM: Multiomický přístup pro diagnózu a monitoring léčby u pediatrických pacientů trpících idiopatickými střevními zánět (Jakub Rozhon)

17:15 – 17:30 Farmakokinetické studie nových psychoaktivních látek s využitím UHPLC MS/MS

• Magdaléna Vágnerová

Na celosvětovém trhu s drogami se v posledních letech čím dál tím více rozšiřují tzv. nové psychoaktivní látky (NPS, z angl. New Psychoactive Substances). Většinou se jedná o analogy existujících kontrolovaných drog, nebo o nově syntetizované látky, které jsou vytvořeny tak, aby napodobovaly či rozšiřovaly psychoaktivní účinky již známých a zakázaných látek. Tyto sloučeniny často nejsou kontrolovány mezinárodními zákony o drogách a mohou být distribuovány bez omezení na veřejně přístupných internetových stránkách. NPS obecně představují velké zdravotní a sociální hrozby podobné těm, které jsou spojeny se známějšími kontrolovanými látkami. V důsledku užití těchto látek již byla zaznamenána celá řada akutních intoxikací a úmrtí. Za účelem získávání vědeckých poznatků charakterizujících zdravotní rizika NPS je nutné provádět rozsáhlé toxikologické testy a klinické studie. Přestože jsou konkrétní NPS na trhu i několik let, jejich farmakologické a toxikologické účinky často nebývají důkladně prozkoumány. Jedním z primárních kroků je pochopení farmakokinetiky, k čemuž je nezbytná komplexní analýza biologických vzorků. Během farmakokinetických studií se sleduje koncentrace látky a jejích hlavních metabolitů v biologickém materiálu v závislosti na čase. Tato práce se zabývá vývojem a validací UHPLC-MS/MS metod pro analýzu aktuálních NPS – methoxfenidinu (MXP), hexahydrokanabinolu (HHC) a 25E-NBOH – v biologickém materiálu v rámci farmakokinetických studií. Jako reálné vzorky byly využity tkáně a krevní sérum potkanů kmene Wistar. Vzhledem k složitosti matrice byl kladen důraz na eliminaci matricového efektu. Byly vyzkoušeny a porovnány různé extrakční metody – proteinová precipitace, extrakce kapaliny kapalinou, vysolování či extrakce pevnou fází. V rámci optimalizace chromatografických podmínek byl zohledněn výběr kolony, nástřik vzorku, složení mobilních fází, gradient a průtok mobilních fází, aby analýza poskytovala co nejlepší chromatografické rozlišení analytů v co nejkratším čase. Vyvinuté metody byly úspěšně validovány podle doporučení Evropské lékové agentury (EMA) a byly použity pro analýzu reálných vzorků potkaních tkání a krevního séra po podání příslušné NPS. Získaná data slouží k vytvoření farmakokinetických křivek jednotlivých NPS, které jsou dále korelovány s behaviorálními studiemi potkanů, které vedou k hlubšímu pochopení farmakologických účinků studovaných NPS.

SSJMM: Farmakokinetické studie nových psychoaktivních látek s využitím UHPLC MS-MS (Magdaléna Vágnerová)

17:30 – 17:45 Effect of Side Chain Functional Groups on Nitrile Imine CrossLinking in Peptide Gas-Phase Ions

• Mikuláš Vlk

Photochemical cross-linking is a widely adopted method for studying protein-protein and protein-nucleic acid complexes. A phototag attached to the studied compound undergoes photodissociation, forming a transient reactive intermediate that rapidly reacts with the proximal functional groups to form a covalent bond. Nitrile imines, produced by dissociation of 2,5-diaryltetrazole tags have been shown to be effective cross-linkers in gas-phase peptide ions. The tetrazole group attached to the peptide C-terminus readily dissociates upon UV light irradiation, forming a nitrile imine moiety that selectively cross-links to the N-terminal peptide chain residue and forms a cyclic peptide structure.

To investigate the effects of side chain functional groups on cross-linking, we varied the N-terminal residues of tetrazole-peptide conjugates and studied the gas-phase ions using tandem mass spectrometry, cyclic ion mobility, Born-Oppenheimer molecular dynamics (BOMD) and density functional theory (DFT) calculations. To gain further insight into the reactivity of N-terminal amide and side chain groups, we introduced specific modifications: esterification of the Asp and Glu side chain carboxyl groups, and methylation of the Lys amine group. Furthermore, exhaustive hydrogen-deuterium exchange and accurate mass measurement provided valuable information regarding the fragment identity.

The conjugates were subjected to UVPD dissociation in the MS2 step, forming -N2 fragments with up to 41% efficiency. The -N2 fragments were isolated and further fragmented by CID-MS3 with cross-linking yields ranging from 40% to 89%, demonstrating a high efficiency of the cross-linking process. Several fragmentation pathways were identified alongside the linear peptide chain fragmentation. Conjugates with N-terminal basic amino acid residues showed a prevalent loss of phenylhydrazine followed by a loss of neutral internal residues, indicating cyclization of the peptide. The atypical loss of the N-terminal residue side chain and subsequent internal amino acid neutral losses pointed toward cross-linking at the N-terminal amide. Losses of internal neutral residues within the peptide chain confirmed cyclization. Cyclic ion mobility measurements and BOMD and DFT calculations provided complementary information regarding the gas-phase conformation of the conjugates and reaction thermodynamics.

Our multimodal approach allowed us to investigate the effects of side chain functional groups on nitrile imine cross-linking of peptide gas-phase ions, probing the applicability of this novel method.

SSJMM: Effect of Side Chain Functional Groups on Nitrile Imine CrossLinking in Peptide Gas-Phase Ions (Mikuláš Vlk)

17:45 – 18:00 Efektivní extrakce a purifikace vzorků z buněčných populací kořenové špičky Arabidopsis thaliana

• Pavel Hladík

Správný růst a vývoj rostlin je řízen rostlinnými hormony neboli fytohormony. Stanovení těchto chemicky různorodých sloučenin v rostlinných extraktech je velmi náročné z důvodu jejich velmi nízké koncentrace, která se pohybuje v pmol až fmol na gram rostlinné hmoty. Další překážkou v jejich stanovení je navíc komplexnost rostlinného metabolomu, jenž dosahuje až stovky tisíc sloučenin, které jsou přítomny na mnohem vyšších hladinách a vytvářejí silné matriční efekty. Nicméně, díky velkému rozvoji přístrojového vybavení a vývoji mikro-extrakčních a purifikačních metod v posledních letech, jsme schopni provádět analýzu fytohormonů v řádech miligramů rostlinného materiálu.

Každý rostlinný hormon, narozdíl od živočišných, ovlivňuje v rostlině velké množství vývojových procesů na základě jeho koncentrace a místa účinku. Z tohoto důvodu je důležité sledovat jejich množství v konkrétních buněčných typech a organelách. V našem výzkumu byl využit fluorescenčně aktivovaný průtokový cytometr (FACS), kterým byly tříděny fluorescenčně značené buněčné populace z kořenové špičky modelové rostliny huseníčku rolního (Arabidopsis thaliana). Z těchto populací byly následně extrahovány a kvantifikovány metabolické profily rostlinných hormonů pomocí kapalinové chromatografie ve spojení s tandemovou hmotností spektrometrií (LC-MS/MS).

Tato metodika nicméně přináší několik úskalí, a to jak již zmiňované nízké hladiny fytohormonů, tak také vysoké koncentrace solí v třídícím pufru. Pro měření je tedy nutné vzorky odsolit, a zároveň zachovat vysokou návratnost těchto procesů. Pro tento účel byla testována mikro-extrakce na tuhé fázi pomocí plněných špiček (μSPE-PT), která byla využita v již dříve publikovaných pracích. Tato metoda nicméně prokázala špatnou robustnost, a proto byla optimalizována extrakce na tuhé fázi s disperzní matricí (DSPE), která vykazuje dobrou linearitu, robustnost a návratnost analytů, a umožňuje nám kvantifikovat rostlinné hormony v populacích obsahujících pouze 50 000 buněk. Cílem této práce je tedy vyvinout analytickou metodu, která poslouží pro sestrojení detailní mapy rostlinných hormonů v kořenové špičce A. thaliana.

SSJMM: Efektivní extrakce a purifikace vzorků z buněčných populací kořenové špičky Arabidopsis thaliana (Pavel Hladík)

18:00 – 18:30 Vysoké rozlišení, citlivost a rychlost díky Xevo MRT

• Alex Muck (Waters)

SSJMM: Vysoké rozlišení, citlivost a rychlost díky Xevo MRT (Alex Muck (Waters))

19:00 – 20:30 Večeře/raut

20:30 – ??? Společenský večer firmy Waters / slavíme 25. ročník školy MS. Hudba: DJ Filip