Elektroforéza – úspěšná analytická metoda

Vznik elektroforézy jako analytické separační metody je datován do roku 1937, kdy Arne Tiselius publikoval práci o elektroforetické separaci proteinů v krevním séru (viz článek Bohuslava Gaše, Vesmír 2001). Od té doby se elektroforéza rozvinula v jednu z nejefektivnějších analytických a preparativních metod.) Elektroforéza umožňuje separovat jak látky iontové, tak i neutrální povahy. V posledních dvou desetiletích vedlo spojení kapilární elektroforézy s vysoce citlivou detekcí na bázi laserem indukované fluorescence (obr. 1) a s hmotnostní spektrometrií (obr. 2) k vývoji analytických metod s širokým uplatněním v biologických vědách.

DNA

Nejúspěšnější aplikací kapilární elektroforézy jak po stránce vědecké, tak i komerční je sekvenování kyseliny deoxyribonukleové (DNA). Intenzivní rozvoj kapilární elektroforézy započal v roce 1990, kdy byl vyhlášen celosvětový projekt určení sekvence lidského genomu s předpokladem jeho splnění za 15 let. Hlavním cílem bylo určit počet genů z kompletní sekvence přibližně 3 miliard nukleotidových bází lidského genomu. Na začátku projektu bylo zvažováno několik analytických metod jako možných kandidátů pro tento gigantický projekt: kapilární elektroforéza, elektroforéza na ultratenkých gelových deskách, hmotnostní spektrometrie a různé neseparační metody sekvenování. Již v roce 1996 byla dosažena úroveň stanovení 1000 nukleotidů při elektroforetické separaci v jedné kapiláře. Zároveň bylo technicky zvládnuto použití svazků až sta separačních kapilár v jednom přístroji. Navíc ve srovnání s klasickými metodami elektroforézy na gelových deskách nabízely kapiláry velkou rychlost a účinnost separací a automatizaci celé analýzy.

Vesmír: Obr. 1

V roce 1998 vyrobila firma Perkin Elmer – Biosystems (později Applied Biosystems) první sekvenátory (ABI PRISM model 3700) se svazky 96 separačních kapilár. Společnost Celera Genomics pod vedením Craiga Ventera použila 230 těchto přístrojů k analýze lidského genomu. Výsledkem bylo, že jako první prezentovali pracovní verzi sekvence lidského genomu již v červnu roku 2000. Další upřesnění bylo publikováno v roce 2003, kdy byl projekt určení sekvence lidského genomu ukončen s nižšími náklady a o dva roky dříve, než bylo plánováno. Jedním z hlavních předpokladů tohoto úspěchu bylo použití technicky vyspělých automatizovaných přístrojů pro kapilární elektroforézy. Zajímavá jsou některá fakta. Za pouhých 9 měsíců byla přečtena sekvence 14,8 miliard nukleotidových bází detekovaných na více než 27 milionech záznamů separací, kde každý přinesl informaci o sekvenci přibližně 550 nukleotidů. Byl tak 5,1krát pokryt genom 5 lidí a bylo dosaženo konsenzu v sekvencích 2,91 miliardy bází v euchromatických částech (tj. bohatých na geny) lidského genomu. Tento projekt je považován za doposud největší uskutečněný v biologii.

Vesmír: Obr. 2

Vysoce výkonné multikapilární sekvenátory a sofistikovaná metodologie našly uplatnění řadou aplikací v oborech jako klinická diagnostika, obzvláště k detekci mutací pro prenatální diagnostiku a genetický screening, genotypování, určování otcovství atd. Pro přehlednou orientaci lze zmínit obsažné retrospektivní zhodnocení shrnující více než 700 původních prací.)

Zvýšená potřeba nových sekvenčních dat urychlila vývoj nových strategií, které již nejsou založeny na elektroforetické separaci. Zdá se, že nejprogresivnější je idea sekvenování v reálném čase syntézy molekul DNA polymerázou, tedy enzymem, který řídí syntézu DNA v buněčném jádře. První experimenty potvrzují, že by mělo být možné přečíst lidský genom během několika desítek minut.) Za těchto okolností se idea rutinního sekvenování genomů jako součást osobnostní zdravotní péče může brzy stát realitou.

Proteiny

Nejrozšířenější aplikací elektroforézy je oblast analýz proteinů v biologických a klinických laboratořích. Jedná se především o dvojrozměrnou elektroforézu, která umožňuje rozlišení více než 10 000 proteinů v jednom experimentu. V oblasti proteomiky (vědy o zastoupení a funkci proteinů v živých systémech) je tato metoda využívána jako jeden ze separačních kroků složité směsi proteinů před jejich identifikací pomocí hmotnostní spektrometrie. Přestože hmotnostní spektrometrie poskytuje rozlišení až jeden milion, tedy schopnost identifikovat dvě látky, které se liší jednou miliontinou své molární hmotnosti, je nutné přírodní směsi proteinů před uvedením do hmotnostního spektrometru separovat. Je to pochopitelné, když si uvědomíme, že jednotlivé buňky mohou obsahovat až několik desítek tisíc různých proteinů o různě velkém zastoupení od jednotek až po několik miliard kopií. V praxi jsou tedy směsi proteinů z buněčných lyzátů separovány nejprve dvojrozměrnou elektroforézou a obsah jednotlivých zón je potom jednotlivě přiveden na kolonu gradientové vysoce účinné kapalinové chromatografie spojené přímo s hmotnostním spektrometrem. Kombinací těchto čtyř vysoce selektivních separačních metod lze identifikovat strukturální odlišnosti nebo fyziologické změny v proteinové struktuře živých organismů. Této strategie se také využívá při hledání významných molekul, tzv. „markerů“, které jsou specifické pro nejrůznější onemocnění a pomáhají při jejich diagnóze.

Stereoizomery

Separace a analýza optických izomerů přitahuje již léta velký zájem prakticky všech přírodovědních oborů. Je velmi dobře známo, že enantiomery stejné substance mohou vykazovat zcela odlišné biologické a farmakologické aktivity. Biologická odezva na receptorech buněk je chirální. Např. dva terpenické enantiomery, (+)carvon a (–)carvon, mají výraznou vůni, první voní jako máta a druhý jako kmínové semeno. Tragickým příkladem farmakologické interakce enantiomerů s různými receptory je historicky velmi známý příklad thalidoimidu, který byl prodáván jako racemická směs na začátku šedesátých let. Později byl zakázán, protože se prokázalo, že antidepresivní účinky má pouze jeden enantiomer, zatímco druhý je mutagenní. Výsledkem užívání thalidoimidu bylo pak mnoho deformovaných novorozenců. Význam chirálních separací je tedy značný, zejména pro kontrolu čistoty léčiv.

Separace jednotlivých enantiomerů není snadný úkol, neboť mají stejné fyzikálně-chemické vlastnosti. Jsou však výjimky, kde matka příroda nabízí přirozené rozlišení enantiomerů, které dokáže objevit zkoumavý pohled genia. Byl to Louis Pasteur, který jako první separoval racemickou směs. Při pečlivém zkoumání si všiml, že krystaly vinanu sodnoamonného, které vznikají ve vinných sudech, tvoří při teplotách nižších než 28 ˚C dvě skupiny, lišící se navzájem trojrozměrnou strukturou. Obě skupiny krystalů stejného chemického složení byly navzájem k sobě jako zrcadlové obrazy. Pasteur se vybavil pinzetou, mikroskopem a velikou trpělivostí a krystaly roztřídil. Potom prokázal, že obě skupiny mají stejné fyzikálně-chemické vlastnosti, avšak při interakci s polarizovaným světlem otáčejí jeho rovinu navzájem opačným směrem.

Také iontové pohyblivosti dvou enantiomerů jedné látky jsou stejné a jejich rozlišení je možné jen na základě různých efektivních pohyblivostí v přítomnosti vhodného chirálního selektoru, který s nimi specificky interaguje. Nejčastěji používané chirální selektory využívají tvorbu inkluzních komplexů či tvorbu iontových párů. Jako nejúčinnější se ukázaly nativní a derivatizované cyclodextriny, chirální crown ether (18-crown-6) a macrocyklická antibiotika vancomycin a teicoplanin.)

Imunitní interakce

Spojení zřejmě nejvyšší dosažitelné chemické selektivity, kterou poskytuje imunitní vazba antigenu a protilátky a rychlé a účinné separace kapilární elektroforézou, je velmi slibné pro praktické aplikace. Rutinní vysoce citlivá detekce na bázi laserem indukované fluorescence v kapilárách je i v tomto případě předpokladem imunofluorescenční identifikace stopových množství daných molekul v mnohem koncentrovanějších složitých matricích biologických vzorků. Byly demonstrovány detekce pikomolárních (10–12 M) až zeptomolárních (10–21 M) koncentrací fluorescenčně značených látek. V řadě případů mohou být separovány protilátky, antigeny a jejich komplexy ve volných roztocích, což má velký význam pro potenciální automatizaci. Publikované aplikace pokrývají široké pole od lékařské diagnostiky přes monitorování životního prostředí a toxikologii.

Analýza chemického obsahu jediné buňky

V nedávné době byla prokázána možnost analyzovat vzorky o objemech menších než pikolitr v kapilárních a mikrofluidických systémech (obr. 3) v kombinaci s detekcí pomocí laserem indukované fluorescence, elektrochemických reakcí a hmotnostní spektrometrie. To odstartovalo novou éru v biologické a diagnostické praxi, éru velmi citlivých analýz obsahu jednotlivých buněk, či dokonce buněčných organel. Analýza jediné buňky může přinést cenné informace o přítomnosti charakteristických látek a chemických změnách v buňce, a to mnohem přesněji a spolehlivěji než analýza buněčných extraktů a produktů homogenizace buněčných populací. V tomto případě je vždy jejich přirozená heterogenita zprůměrována. Analýzou jednotlivých buněk tak můžeme získat nové poznatky o fyziologii buněčného cyklu, množení, diferenciaci a buněčné smrti. Důležitým výsledkem je také srovnávání morfologických a fyziologických změn. Tento typ analýz může být potřebný zejména v situacích, kdy jen velmi omezený počet buněk dané populace vykazuje odlišné chemické chování nebo produkuje specifické látky. Monitorování významných molekul na buněčné úrovni dovolí odhalit i raná stadia chorob, zejména zhoubného bujení, dříve než nastanou změny tělesné a fyzické.

Vesmír: Obr. 3

Byly ověřeny systémy pro zavedení zvolené buňky do kapiláry, po němž následuje její destrukce, separace ionogenních komponent a detekce. Buněčná stěna může být destruována např. osmoticky v elektrolytu s nízkou iontovou silou, v roztoku povrchově aktivních látek, intenzivním elektrickým polem, ultrazvukem či ozářením laserem. Značných pokroků bylo dosaženo v oblasti analýz vybraných proteinů v jednotlivých buňkách, kde byla klíčová jejich identifikace pomocí hmotnostní spektrometrie. Velmi vhodné pro integraci všech procesů nutných pro analýzu jednotlivých buněk jsou planární struktury mikrofluidických zařízení.

Použití mikrofluidických zařízení a vyspělých optických a spektroskopických metod přineslo dosud nebývalé zvýšení citlivosti detekce, která dosahuje v některých případech až absolutní hodnoty, tedy schopnosti detekovat jednotlivé molekuly. Výzkum detekce a identifikace jednotlivých molekul je jeden z nejatraktivnějších vědeckých směrů současnosti. Analýzy jednotlivých molekul nepotřebují žádné koncentrování či amplifikaci analytu, naopak, preferovány jsou velmi zředěné roztoky a není již třeba selektivních separačních procesů. Bezesporu nejvýraznější úspěch v této oblasti představuje experimentální potvrzení možnosti sekvenovat jednotlivé molekuly DNA, jak bylo popsáno výše.

Efektivní elektroforetická pohyblivost

Velká část látek se v roztocích chová jako slabý, tedy ne úplně disociovaný elektrolyt. Tyto látky jsou v roztocích přítomny částečně jako ionty a částečně jako neutrální molekuly. Z makroskopického hlediska se celý soubor neutrálních molekul a různých iontů, které jsou navzájem ve velmi rychlé dynamické rovnováze, pohybuje v elektrickém poli jako jeden celek s určitou efektivní elektroforetickou pohyblivostí. Z toho vyplývá, že volba vhodného pH roztoků je jedním z nejvýraznějších nástrojů jak v elektroforéze měnit efektivní pohyblivosti látek, aby se dosáhlo požadované separace. Dalším nástrojem jsou komplexotvorné rovnováhy, interakce typu hostitel-host, které našly nejvíce uplatnění především pro chirální separace.

Dvojrozměrná desková elektroforéza

V prvním rozměru jsou látky separovány izoelektrickou fokusací v polyakrylamidovém gelu. Využívá se zde amfoterních vlastností separovaných látek. Podél migrační dráhy je vhodnou volbou elektrolytového systému vytvořen monotónní gradient pH. Po vnesení vzorku a aplikaci elektrického pole se amfoterní nabité látky dávají do pohybu a migrují tak dlouho, až se octnou v místě, kde pH daného gradientu je rovno jejich izoelektrickému bodu, jejich výsledný náboj je nulový, a tudíž se zastaví. První rozměr separace tedy poskytne koncentrované zóny proteinů seřazené podle svých izoelektrických bodů podél migrační dráhy v gelu. V druhém kroku je tento pás gelu s částečně separovanými proteiny vložen jako startovní pás do denaturačního polyakrylamidového gelu. Proteiny jsou dále separovány podle svých molárních velikostí ve směru kolmém k izoelektrické fokusaci a tvoří charakteristické zóny. Jejich detekce je založena na následném značení pomocí barevných, fluoreskujících nebo radioaktivně značených látek.

Elektroforéza v gelech nebo roztocích polymerů

V analytické praxi se setkáváme s homogenními polyelektrolyty, které mají stejný poměr náboje a velikosti, a tím i stejné pohyblivosti. Příkladem jsou fragmenty DNA, které se mohou značně lišit délkou, avšak platí u nich, že prodloužení délky o jeden nukleotid přináší zároveň jeden náboj fosfátové skupiny. Poměr náboje a hmotnosti se tak prakticky nemění, a nelze je tedy navzájem separovat ve volných roztocích. Jestliže se však pohybují molekuly DNA nebo jiných homogenních polymerů v prostředí gelu nebo roztoku polymeru tvořeném navzájem propletenými vlákny tohoto separačního média, musí migrující molekuly překonávat tyto překážky. Čím větší je délka migrující molekuly, tím více je její pohyb omezen. Dlouhé řetězce se tedy pohybují nižší rychlostí než řetězce krátké a výsledkem je jejich vzájemná separace.