Od roku 1994 kdy poprvé Chalfie s jeho kolegy provedl izolaci, se stal Zelený fluorescenční protein (GFP) nesmírně populárním a výkonným nástrojem pro neinvazivní sledování buněčných procesů in vivo. GFP je protein složený z 238 aminokyselin, který se izoluje z medúzy Aequorea victoria. Protein má elegantní strukturu β-barelu o velikosti 30 x 40 Å, která chrání vnitřní tripeptidový fluorofor (Obrázek 1).
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Altium_International_Obrazek_1_Schematicke_zobrazeni_zeleneho_fluorescencniho_proteinu_Cervene_je_zobrazen_tripeptidovy_fluorofor_8b0e404fec.jpg" alt="Altium International: Obrázek 1. Schématické zobrazení zeleného fluorescenčního proteinu. Červeně je zobrazen tripeptidový fluorofor"/>
Po excitaci světlem při 395 nm nebo 475 nm fluorofor GFP emituje jasnou zelenou fluorescenci při 509 nm. Tento jev může být detekován použitím různých instrumentů – jako je fluorescenční mikroskop, fluorescenční průtokový cytometr a fluorimetr. 
GFP je vysoce atraktivní nástroj pro dnešní vědce v oborech „life science“, hlavně protože protein nepotřebuje další substráty a kofaktory pro dosažení funkční struktury proteinu. Díky tomu je možná exprese GFP v oblasti živých organismů a buněčných systémů, což má za následek maturaci a fluorescenční signál. Jinými slovy GFP umožňuje buňkám produkovat jejich vlastní fluorescenční marker. 
Díky tomu je pak možné obejít použití konvenčních fluorescenčních zobrazovacích postupů, při kterých dochází často k toxickému ovlivnění buněk a nelze tak obecně provádět studie in vivo. GFP dovoluje studie buněčných procesů v reálném čase v živých buňkách, intaktních buňkách a organismech, které umožňují lepší porozumění biologickým mechanismům ve fyziologických modelech.
Jedna z prvních aplikací GFP bylo využití GFP jako reportéru genové exprese a proteinové lokalizace. GFP byl použit k vizualizaci buněčných organel, cytoskeletonu a sekreční dráhy. Od té doby se již výrazně rozrostly aplikace GFP a jeho derivátů, které byly vyvinuty.
Mutační studie chromoforů a okolních aminokyselin vyprodukovaly nové deriváty GFP s odlišnými excitačními a emisními spektry. Těmito deriváty jsou modrý (BFP), tyrkysový (CFP) a žlutý (YFP) fluorescenční protein. Všechny tyto barevné proteiny mají vylepšené maturační hodnoty a fluorescenční intenzity. Barevné spektrum bylo nedávno rozšířeno Matzem a jeho spolupracovníky, kteří izolovali červený fluorescenční protein z Discosomy coral (dsRed), s 30% sekvenční homologií s Aequorií GFP. Tato široká škála spektrálně odlišných fluorescenčních proteinů poskytuje rozeznatelné markery pro simultánní studie vícenásobných buněčných procesů, stejně jako umožňuje pokročilejší aplikace. Příkladem může být studie interakcí protein-protein s použitím jevu fluorescenčního rezonančního přenosu energie (FRET).
Fluorescenční vlastnosti rodiny GFP jsou odlišné v případě spektrálního profilu, intenzity a citlivosti vůči stabilitě signálu. Proto je důležité optimalizovat detekční a měřící protokoly pro GFP a jeho deriváty ještě před experimentální analýzou v každém experimentálním modelu. Prezentovaná studie má za cíl detekovat a charakterizovat GFP exprimované v cytosolu živých kvasinkových buněk (Saccharomyces cerevisiae) s použitím fluorescenčního spektrofotometru <a href="https://lcms.cz/products/718">Agilent Cary Eclipse</a>.
<h3>Materiál a metody</h3>
<h5>Vybavení:</h5>
<ul>
<li>Agilent Cary Eclipse fluorescenční spektrofotometr</li>
<li>Vícekyvetový držák s Peltierovým chlazením a elektromagnetickým mícháním</li>
<li>Teplotní kontrolér</li>
<li>Teplotní sondy</li>
<li>Magnetická míchadélka</li>
<li>Křemenné kyvety</li>
</ul>
<h5>Kmeny kvasinek</h5>
YRD15 (MATα, his3, ura3, leu2,p+) kvasinek S. cerevisiae byl mateřský kmen použitý v této studii. Geny kódující GFP deriváty (žlutý, zelený, modrý, tyrkysový) a červený fluorescenční protein (DsRED) byly klonovány do kvasinkového expresního plasmidu pAS1N a transformovány do kvasinkového kmene YRD15, který je popsán výše. Transformované buňky byly naneseny na kvasinkové minimální médium (0,75% kvasinkové minimální médium bez aminokyselin, 2% glukóza, 1,5% agar) se selektivními markery kultivované 3 až 5 dnů při teplotě 28 °C.
<h5>Postup</h5>
Kvasinky byly dvakrát promyty v 1 ml MiliQ vody, aby byla odstraněna kontaminující média, poté byly resuspendovány v MiliQ vodě na konečnou optickou hustotu 0,55 Abs při 650 nm. Buněčné suspenze (2ml) byly umístěny do jednorázových fluorescenčních kyvet (Sarstedt) a do vícekyvetového držáku, který byl umístěn do vzorkovacího prostoru <a href="https://lcms.cz/products/718">Cary Eclipse fluorescenčního spektrofotometru</a>. Teplota v kyvetách byla nastavena na 25 °C. S použitím SW modulu „Scan“ byla buněčná suspenze excitována světlem náležité vlnové délky pro každý specifický fluorescenční protein (viz webová stránka Clontech – komplexní list excitačních/emisních maxim fluorescenčních proteinů). Emisní skeny byly zaznamenány pro GFP, BFP, CFP, YFP a DsRed. Parametry měření skenů DsRed jsou uvedeny v Obrázku 2.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Altium_International_Obrazek_2_Instrumentalni_parametry_pro_detekci_emisniho_spektra_Ds_Red_emisni_maximum_583_nm_a_excitace_55_O_nm_excitace_558_nm_57e3d569f6.jpg" alt="Altium International: Obrázek 2. Instrumentální parametry pro detekci emisního spektra *DsRed* (emisní maximum 583 nm) a excitace 55O nm (excitace 558 nm)"/>
<h3>Výsledky a diskuze</h3>
Emisní spektra všech fluorescenčních proteinů jsou znázorněna na Obrázku 3.
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Altium_International_Obrazek_3_Intenzita_vs_emise_fl_uorescencnich_proteinu_pro_cele_spektrum_e9bb31f3e7.jpg" alt="Altium International: Obrázek 3. Intenzita vs. emise fluorescenčních proteinů pro celé spektrum"/>
Spektra všech fluorescenčních proteinů, jejichž exprese probíhala v cytosolu kvasinkových buněk, byla snadno zaznamenána a spektra korespondují s očekávanými charakteristikami. Šum, produkovaný buněčnou autofuorescencí, a rozptyl byly zanedbatelné, zejména v důsledku použití vnitřních filtrů, kterými je vybaven jak emisní tak i excitační monochromátor v Agilent Cary Eclipse. Snížení autofluorescence (buď zkoumaného vzorku nebo média) je nesmírně důležité při použití fluorescenčních proteinů, které mají buď nízkou intenzitu fluorescence, nebo jsou excitovány vysoce energetickým UV zářením (jako například BFP). UV záření iniciuje silné fluorescenční odezvy z mnoha složek buněčné prostředí a musí být minimalizovány, aby se zabránilo maskování emise z cílových fluorescenčních proteinů, zejména když se sledují drobné interakce proteinů.
<h3>Závěr</h3>
<a href="https://lcms.cz/products/718">Agilent Cary Eclipse s vícekyvetovým držákem a příslušenstvím</a> pro teplotní kontrolu poskytuje jednoduché, rychlé a reprodukovatelné řešení pro měření a charakterizaci různých fluorescenčních proteinů exprimovaných v celých buňkách. Nyní existuje příležitost specificky označit proteiny zájmu uvnitř buněk pomocí různých GFP a sledovat tak interakce současně pomocí měření při několika vlnových délkách – to umožňuje automatickou excitaci a odečítání emise až pro šest různých fluorescenčních sond in vivo.
<blockquote>
<h4><a href="https://lcms.cz/products/718">Agilent Cary Eclipse fluorescenční spektrofotometr</a></h4>
</blockquote>
<blockquote>
Cary Eclipse fluorescenční spektrofotometr nabízí vysoký výkon, jež můžete očekávat jen od Cary. S technologií zábleskové xenonové výbojky, elektronikou &quot;plug-and-identify&quot; a funkcemi nabitým intuitivním softwarem, ztělesňuje tento přístroj jméno Cary. Přístroje našly své uplatnění v mnoha rutinních laboratořích po celém světě, kde je nezbytná jejich spolehlivost a snadné použití.
</blockquote>
<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Agilent_Cary_Eclipse_fluorescencni_spektrofotometr_0_5411fd3bbd/Agilent-Cary-Eclipse-fluorescencni-spektrofotometr_0.jpg" alt="Altium International: Agilent Cary Eclipse fluorescenční spektrofotometr"/>

Cytosolová exprese Zeleného fluorescenčního proteinu (GFP) a jeho derivátů v kvasinkách Saccharomyces cerevisiae

Agilent nabízí dokonalá řešení v molekulární spektroskopii, která dokáží oslovit vědce zabývající se materiálovým výzkumem, odborníky v průmyslovém výzkumu a vývoji, pracovníky řízení kvality, akademické výzkumníky či farmaceuty.S více než 60 lety zkušeností Vám Agilent nabízí ucelenou řadu UV-Vis, UV-Vis-NIR, FTIR&nbsp;a fluorescenčních&nbsp; spektrometrů, které jsou navrženy tak, aby vám pomohly objevit, charakterizovat a testovat různé pevné, kapalné, organické a anorganické materiály. Využijte síly strojů Agilent pro Vaše analýzy a získejte vždy přesné a spolehlivé výsledky snadno a efektivně.Vedle řešení Agilent naleznete v nabídce i UV-Vis spektrofotometry od shanghaiského výrobce METASH - JEDNOPAPRSKOVÉ spektrofotometry a DVOUPAPRSKOVÉ spektrofotometry<h4>Agilent Cary 60 UV-Vis spektrofotometr</h4><ul><li><a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://hpst.cz/molekulova-spektroskopie/uvvis-spektrofotometry/agilent-cary-60">Produktová stránka Altium</a></li><li><a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://icpms.cz/products/631">Produktová stránka LabRulez</a></li></ul>Skvělý pomocník především pro rutinu i výzkum. Jedinečný optický design s xenonovou zábleskovou lampou. Kdykoliv připraven měřit, s vysokou rychlostí a spolehlivostí. Vysoce odolný s mnohaletou výdrží.<ul><li>Duální paprsek</li><li>190 – 1100 nm</li><li>Silikonové fotodiody</li><li>24 000 nm/min</li></ul>CENA: Od 200 000 Kč bez DPH<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Altium_UV_Vis_spektrofotometr_Cary_60_s_PC_6352827f92.jpg" alt="Altium: UV-Vis spektrofotometr Cary 60 s PC" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Altium_UV_Vis_spektrofotometr_Cary_60_s_PC_6352827f92.jpg 214w," sizes="100vw" width="1600" height="1170"><h4>Agilent Cary 3500</h4><ul><li><a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://hpst.cz/molekulova-spektroskopie/uvvis-spektrofotometry/agilent-cary-3500">Produktová stránka Altium</a></li><li><a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://icpms.cz/products/628">Produktová stránka LabRulez</a></li></ul>Nový a unikátní spektrofotometr. Jedinečné uspořádání spektrofotometru umožní měření až 8 vzorků zároveň v ten samý okamžik.Skvělé možnosti termostatování, rychlé nastavení teploty, velký rozsah, případně i různá teplota na jednotlivých kyvetách. Vysoká přesnost, vysoká průchodnost vzorků.<ul><li>Dvoupaprskový</li><li>190-1100 nm</li><li>150 000 nm/min</li><li>Měření až 8 vzorků zároveň</li></ul>CENA: Od 400 000 Kč bez DPH<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Altium_UV_Vis_spektrofotometr_Cary_3500_se_software_Cary_UV_Workstation_0cd496e665.jpg" alt="Altium: UV-Vis spektrofotometr Cary 3500 se software Cary UV Workstation" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Altium_UV_Vis_spektrofotometr_Cary_3500_se_software_Cary_UV_Workstation_0cd496e665.jpg 245w," sizes="100vw" width="1600" height="653"><h4>Agilent Cary 630</h4><ul><li><a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://hpst.cz/molekulova-spektroskopie/ftir-mobilni-rutinni-spektrometry/agilent-cary-630-ftir-spektrometr">Produktová stránka Altium</a></li><li><a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://icpms.cz/products/646">Produktová stránka LabRulez</a></li></ul>Nejmenší FTIR na světě se skvělou výkoností. Skvělý pomocník především pro rutinní měření, nebo například pro studenty. Jednoduché zacházení, a to i díky velice intuitivnímu a návodnému softwaru.Velice variabilní a nabízí širokou škálu příslušenství (ATR, transmise, DRIFTS a další.)CENA: Od 400 000 tisíc Kč bez DPH<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/HPST_Prislusenstvi_pro_Cary_630_FTIR_spektrometr_1a10ad8b3e/HPST-Prislusenstvi-pro-Cary-630-FTIR-spektrometr.jpg" alt="Altium: Příslušenství pro Cary 630 FTIR spektrometr" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_HPST_Prislusenstvi_pro_Cary_630_FTIR_spektrometr_1a10ad8b3e/thumbnail_HPST-Prislusenstvi-pro-Cary-630-FTIR-spektrometr.jpg 245w," sizes="100vw" width="1413" height="832"><h4>Agilent Vaya Raman spektrometr</h4><ul><li><a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://hpst.cz/molekulova-spektroskopie/ramanovy-spektrometry/vaya">Produktová stránka Altium</a></li><li><a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://icpms.cz/products/682">Produktová stránka LabRulez</a></li></ul>Novinka roku 2020. Ruční Raman pro kontrolu vstupních surovin. Unikátní technologie, díky které je možné měřit i přes neprůhledné materiály oproti klasickým Ramanům.<ul><li>Velká úspora času a nákladů</li><li>Vhodné i pro farmaceutické provozy</li><li>Molekulová spektroskopie Agilent</li></ul>CENA: Od 1,2 milionu Kč bez DPH<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Altium_Mereni_s_Agilent_Vaya_Raman_spektrometrem_080338d23d.jpg" alt="Altium: Meření s Agilent Vaya Raman spektrometrem" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Altium_Mereni_s_Agilent_Vaya_Raman_spektrometrem_080338d23d.jpg 245w," sizes="100vw" width="3176" height="770"><h4>Metash JEDNOPAPRSKOVÉ a DVOUPAPRSKOVÉ spektrofotometry</h4><ul><li><a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://hpst.cz/molekulova-spektroskopie/uvvis-spektrofotometry/metash-jednopaprskove-spektrofotometry">Produktová stránka Altium Metash JEDNOPAPRSKOVÉ spektrofotometry</a></li><li><a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://hpst.cz/molekulova-spektroskopie/uvvis-spektrofotometry/metash-dvoupaprskove-spektrofotometry">Produktová stránka Altium Metash DVOUPAPRSKOVÉ spektrofotometry</a></li><li><a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://icpms.cz/products/724">Produktová stránka LabRulez Metash JEDNOPAPRSKOVÉ spektrofotometry</a></li><li><a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://icpms.cz/products/723">Produktová stránka LabRulez Metash DVOUPAPRSKOVÉ spektrofotometry</a></li></ul>Firma Metash Instruments Co. vznikla v roce 2008, vyrábí laboratorní a výzkumné přístroje. Portfolio firmy tvoří kompletní řada UV-Vis spektrofotometrů, mikrovlnné rozkladné systémy a TOC analyzéry. Standardem přístrojů je vysoká kvalita a dobrý servis. Produkty formy Metash se uplatňují v nejrůznějších odvětvích jako je životní prostředí, potravinářský, kosmetický, chemický a farmaceutický průmysl, ale i oblast biologických věd. Metash dodává přístroje do více než 80-ti zemí po celém světě.<h5>Portfolio Metash</h5><ul><li>Můžeme Vám nabídnout spektrofotometry jak jednopaprskové tak i dvoupaprskové</li><li>Lze vybírat rozsahy od 190 nebo od 325 nm do 1000/1100 nm</li><li>Možnost ovládání přímo ze spektrofotometrů ale i z PC</li><li>Speciální řešení pro měření DNA a RNA – Biofotometr B-500</li></ul>CENA: Od 20 000 Kč bez DPH<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Metash_JEDNOPAPRSKOVE_spektrofotometry_V5000_aa03b70b18/Metash-JEDNOPAPRSKOVE-spektrofotometry_V5000.jpg" alt="Altium: Metash JEDNOPAPRSKOVÉ spektrofotometry V5000" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Metash_JEDNOPAPRSKOVE_spektrofotometry_V5000_aa03b70b18/thumbnail_Metash-JEDNOPAPRSKOVE-spektrofotometry_V5000.jpg 245w," sizes="100vw" width="975" height="615">

Řešení pro molekulovou spektroskopii od Agilent/Altium

Webináře

Aplikace

Akademie

Osobnosti

Plasty

Životní prostředí

Potraviny

Vody

Zdraví

Přednáška

Vědecký článek

Rozhovor

Toxikologie

Popularizace

Věda a výzkum

Software

Covid-19

Kariéra

Článek

Laboratoře

Různé

Produkt

Video

Poster

Nejbližší akce

Typ novinky

Zaměření

Je autorizovaným distributorem společnosti Agilent Technologies pro Českou republiku v oblastech chromatografie (GC, HPLC, UHPLC, kapilární elektroforéza) a hmotnostní spektrometrie (GC/MS, LC/MS, CE/MS), disolučních aparátů, molekulární (UV-Vis, UV-Vis-NIR, fluorescence, FTIR analyzátory a mikroskopy) a atomové spektroskopie (ICP-OES, ICP-MS, AAS), a v neposlední řadě také v oblasti molekulární biologie a genomiky (analýza nukleových kyselin a proteinů, microarray skenery a skla, PCR & RT-PCR, qPCR, řešení pro NGS, reagencie pro mutagenezi a klonování, sondy FISH a další).

Altium International

Představení nové série Reometru společně se softwarem RheoCompas

ALS Kurz Analýzou HYDRAULICKÝCH a TURBÍNOVÝCH olejů k větší efektivitě výroby

Svět měření na dosah: Potravinářské technologie

Novel Advancements in Trace Level Determination and Longterm Stability of Metals in TMAH and UPW matrices

Meet Compact-Q DEER Spectrometer, Your Gateway to Quantum Innovation

Process Raman: A Reliable and Versatile Tool For Downstream Process Monitoring and Control For mAB Production