Benefits of the Cary 3500 Multicell UV-Vis for Protein Analysis

Význam tématu

Analýza proteinů pomocí UV-Vis spektrofotometrie je klíčová pro rychlé stanovení koncentrace, čistoty a specifické aktivity vzorků v biochemickém i průmyslovém prostředí. Miniaturizované měření s ultramikroobjemem umožňuje ušetřit vzácný vzorek a současně zachovat reprodukovatelnost a přesnost.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem publikace je ukázat výhody využití spektrofotometru Agilent Cary 3500 Multicell UV-Vis pro kvalitativní i kvantitativní měření proteinů v nízkém objemu. Příkladová aplikace zahrnuje stanovení koncentrace bovinního sérového albuminu (BSA) v sérii 70µl ultramikro kyvet při současném měření pěti vzorků a jednoho blanku.

Použitá metodika a instrumentace

Instrumentace:

• Spektrofotometr Agilent Cary 3500 Multicell UV-Vis s integrovaným pevným držákem až pro osm kyvet.
• Ultramikro kyvety o objemu 70 µl, apertuře 2 × 2,5 mm a optické dráze 10 mm.
• Standardní quartzové kyvety 3,5 ml, optická dráha 10 mm.

Metodika:

• Příprava PBS pufru (0,01 M, pH 7,0) a 10 mg/ml zásobního roztoku BSA.
• Naředění BSA na koncentrace 0,75–3,75 mg/ml.
• Snímkování v rozsahu 250–350 nm, čas průměrování 1 s, šířka pásma 1–2 nm.
• Simultánní měření blanku a pěti vzorků ve spektru, měření samostatně u standardních kyvet pro srovnání reprodukovatelnosti.

Hlavní výsledky a diskuse

Simultánní měření demonstrovalo vysokou reprodukovatelnost (SD 0,00042 Abs pro ultramikro kyvety vs. 0,00029 Abs pro standardní kyvety) a lineární odezvu až do téměř 2,5 Abs. Absorbance při 278 nm byla úměrná koncentraci BSA, přičemž nulová absorbance při 350 nm potvrdila absenci kontaminantů. Snížení objemu neovlivnilo přesnost ani linearitu díky vysoce kolimovanému paprsku přístroje.

Přínosy a praktické využití metody

Simultánní měření až šesti kyvet šetří čas a eliminuje proměnné spojené s postupnými analýzami (např. teplotní posuny, fotodegradace či chemické změny). Miniaturizovaný přístup s ultramikro kyvetami umožňuje šetřit vzácné biologické vzorky a udržet vysokou přesnost kvantifikace. Metoda je vhodná pro QC laboratoře, bioprocesní výrobu a výzkumná pracoviště.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření simultánní spektrofotometrie do dalších biopolymerních a enzymatických analýz. Integrace s mikrofluidními platformami umožní automatizované sledování reakcí v reálném čase. Vylepšení softwaru pro pokročilou analýzu spekter (dekonvoluce, modelování spektrálních smíšenin) zvýší schopnost detekovat kolizní nebo agregované formy proteinů.

Závěr

Spektrofotometr Cary 3500 Multicell UV-Vis ukázal vynikající linearitu, reprodukovatelnost a schopnost pracovat s velmi nízkými objemy vzorku. Simultánní měření více kyvet významně zvyšuje efektivitu a spolehlivost analýz proteinů v rutinním i výzkumném provozu.

Reference

• Fasman, D.G. (1992) Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, CRC Press, Boston.