Characterization of Protein Thermal Stability Using UV-Vis Spectroscopy

Význam tématu

Termální stabilita proteinů je klíčovým parametrem v oblasti bioterapeutik, protože ovlivňuje skladovatelnost, účinnost a bezpečnost farmaceuticky významných proteinů. Měření Tm (teploty tání) pomáhá pochopit vliv fyzikálně-chemických podmínek, ligandů či modifikací na globální konformaci proteinu a předpovědět optimální podmínky pro jeho výrobu a uchovávání.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace je demonstrovat rychlou a spolehlivou metodu stanovení termální stability modelového proteinu Escherichia coli disulfide bond isomerase A (EcDsbA) pomocí UV-Vis spektrofotometru Agilent Cary 3500 s Peltierem a multicell držákem.

Použitá instrumentace

• Agilent Cary 3500 UV-Vis spektrofotometr
• Peltier teplotně řízený multicell modul (8 pozic)
• Ultramicrocell křemenné kyvety (70 µL, 10 mm optická dráha)
• Agilent Cary UV Workstation software

Použitá metodika

Pro měření byly vzorky EcDsbA (~0,6 mg/mL) připraveny v 100 mM fosfátovém pufru (pH 7,0) se 50 mM NaCl a 1 mM EDTA. Pro stanovení maxima absorpce proběhl spektrální scan 200–400 nm (0,1 s průměrování, šířka pásma 2 nm). Termální tání se sledovalo při 280 nm, ramp rate 0,1 °C/min, měření každých 0,1 °C, průměrování signálu 2 s. Data byla analyzována s využitím první derivace a filtru velikosti 25 bodů.

Hlavní výsledky a diskuse

Maximální absorpční vrchol EcDsbA se nachází na 280 nm. Termální melt křivka odhalila přechod kolem 70 °C a Tm vypočtená ze 6 replikátů činila průměrně 69,86 °C se standardní odchylkou 0,16 °C. Výsledek je v souladu s literárními hodnotami (68,6–69,3 °C). Multicell držák umožnil paralelní analýzu až sedmi vzorků, čímž se zvýšila průchodnost bez ztráty přesnosti.

Přínosy a praktické využití metody

• Minimální spotřeba vzorku (70 µL)
• Žádné fluorescenční značkování
• Rychlé simultánní měření až 8 kyvet
• Vysoká přesnost a reprodukovatelnost (SD 0,16 °C)
• Jednoduchá analýza dat v integrovaném softwaru

Budoucí trendy a možnosti využití

Metoda má potenciál pro rozsáhlé termální proteomické studie, screening ligand-protein interakcí a vývoj stabilizátorů proteinů. Další aplikace zahrnují multi-parametrické analýzy spojující UV-Vis, CD nebo fluorescenční metody v jednom workflow a plnou automatizaci v rámci vysoce průchodných laboratoří.

Závěr

Agilent Cary 3500 UV-Vis spektrofotometr s Peltier multicell modulem poskytuje přesné, rychlé a vysoce reproducibilní stanovení termální stability proteinů s minimální spotřebou vzorku a možností paralelních měření. Metoda je vhodná pro akademická a průmyslová pracoviště zaměřená na vývoj a kontrolu bioterapeutik.

Reference

1. Mohs R.C., Greig N.H. Drug Discovery and Development: Role of Basic Biological Research. Alzheimers Dement (NY) 2017, 3(4), 651–657.
2. Schenone M. et al. Target Identification and Mechanism of Action in Chemical Biology and Drug Discovery. Nat. Chem. Biol. 2013, 9(4), 232–40.
3. Gashaw I. et al. What Makes a Good Drug Target? Drug Discov. Today 2012, 17(Suppl), S24–S30.
4. Jahn T.R., Radford S.E. Folding Versus Aggregation: Polypeptide Conformations on Competing Pathways. Arch. Biochem. Biophys. 2008, 469(1), 100–17.
5. Mateus A., Määttä T.A., Savitski M.M. Thermal Proteome Profiling: Unbiased Assessment of Protein State Through Heat-Induced Stability Changes. Proteome Sci. 2017, 15, 13.
6. Ball K.A. et al. An Isothermal Shift Assay for Proteome Scale Drug-Target Identification. Commun. Biol. 2020, 3, 75.
7. Greenfield N.J. Using Circular Dichroism Collected as a Function of Temperature to Determine the Thermodynamics of Protein Unfolding and Binding Interactions. Nat. Protoc. 2006, 1(6), 2527–35.
8. Beychok S. Circular Dichroism of Biological Macromolecules. Science 1966, 154(3754), 1288–99.
9. Abd-Elghany M., Thomas M.K. A Review on Differential Scanning Calorimetry Technique and its Importance in the Field of Energetic Materials. Physical Sciences Reviews 2018, 3, 4.
10. Deangelis N.J., Papariello G.J. Differential Scanning Calorimetry. J. Pharm. Sci. 1968, 57, 1868–1873.
11. Pantoliano M.W. et al. High-Density Miniaturized Thermal Shift Assays as a General Strategy for Drug Discovery. J. Biomol. Screen. 2001, 6(6), 429–40.
12. Ericsson U.B. et al. Thermofluor-Based High-Throughput Stability Optimization of Proteins for Structural Studies. Anal. Biochem. 2006, 357(2), 289–98.
13. Martin J., Bardwell J., Kuriyan J. Crystal Structure of the DsbA Protein Required for Disulphide Bond Formation In Vivo. Nature 1993, 365, 464–468.
14. Christensen S. et al. Structural and Biochemical Characterization of Chlamydia trachomatis DsbA. PLoS One 2016, 11(12): e0168485.
15. Heras B. et al. Staphylococcus aureus DsbA Does Not Have a Destabilizing Disulfide, a New Paradigm for Bacterial Oxidative Folding. J. Biol. Chem. 2008, 283(7), 4261–71.