Fast Determination of Thermal Melt Temperature of Double-Stranded Nucleic Acids by UV-Vis Spectroscopy

Význam tématu

Stanovení teploty tání dvojvláknových nukleových kyselin je zásadní pro charakterizaci jejich složení a stability. Tm hodnota odráží poměr silnějších G–C vazeb vůči A–T/U a slouží jako rychlý QC test ve farmaceutickém vývoji, biotechnologiích a laboratorní diagnostice.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo ověřit, zda použití vyšších rychlostí ohřevu při UV-Vis spektrofotometrickém stanovení Tm nezhorší reprodukovatelnost výsledku. Měřil se vzorek herring sperm DNA v PBS pufru při šesti různých rychlostech rampy teploty, od 1 až do 40 °C/min, na přístroji Agilent Cary 3500 Multizone UV-Vis.

Použitá metodika a instrumentace

Průběh experimentu:

• Připraven roztok DNA (~15 μg/mL v 0,01 M fosfátovém pufru se 0,137 M NaCl a 0,0027 M KCl, pH 7,4)
• Vzorky a blanková voda v Agilent křemíkových semimikro kyvetách (10 mm, 600 μL) s vrstvicí minerálního oleje proti odpařování
• Měření absorbance při 260 nm, interval 1 °C, průměrovací čas 0,1 s
• Rychlosti rampy teploty: 1, 5, 10, 20, 30, 40 °C/min
• Řízení teploty pomocí vestavěných Peltierových elementů a in-kyvetové sondy

Hlavní výsledky a diskuse

Díky simultánnímu měření až osmi kyvet byly získány Tm hodnoty ve všech rychlostech ohřevu v intervalu 86,5–87,1 °C. Průměrná Tm pro všechny rychlosti činila 86,9 °C se směrodatnou odchylkou 0,2 °C. Výsledky ukázaly, že zvýšení rychlosti ohřevu až na 40 °C/min neovlivnilo přesnost stanovení Tm.

Přínosy a praktické využití metody

Výrazné zkrácení doby měření z původních 2,5 h (0,5 °C/min) na přibližně 10 minut (30–40 °C/min) bez ztráty reprodukovatelnosti umožňuje zvýšit produktivitu laboratoří. Metoda je vhodná pro rutinní QC i výzkumná měření stability nukleových kyselin.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření vysokorychlostních termálních testů na další biomolekuly a kombinace s kinetickými studiemi. Integrace s pokročilými softwarovými nástroji pro automatizaci a vyhodnocování dat přinese další zvýšení efektivity a dodržení regulačních standardů.

Závěr

Studie potvrdila, že rychlé rampy teploty poskytují spolehlivé Tm výsledky s vysokou přesností a významně zkracují dobu analýzy. Agilent Cary 3500 UV-Vis s multizónovou kontrolou teploty představuje flexibilní řešení pro vysokoobjemové termální experimenty.

Reference

1. Shen C-H. Diagnostic Molecular Biology, kap. 7, Academic Press 2019, s. 167–185.
2. Chetana P. R. et al. Inorganica Chimica Acta 2009, 362, 4692–4698.
3. Rao R.; Patra A. K.; Chetana P. R. Polyhedron 2008, 27, 1343–1352.
4. Davis T. M. et al. Biochemistry 1998, 37(19), 6975–6978.
5. Savitzky A.; Golay M. J. E. Anal. Chem. 1964, 36, 1627–1639.