Best Practice for Nucleic Acid Thermal Stability Measurements Using the Cary 3500 UV-Vis Spectrophotometer

Význam tématu

Studium termální stability nukleových kyselin je klíčové pro pochopení jejich struktury, vazeb mezi bázemi a podmínek denaturace a renaturace. Určení teploty tání (Tm) pomáhá optimalizovat podmínky pro PCR, hybridizace a design terapií založených na nukleových kyselinách. Rychlé a přesné měření pomocí termokontrolované UV-Vis spektrofotometrie umožňuje vyhodnocení stability v různých pH, pufrech a s případnými mismatchemi.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem dokumentu je popsat nejlepší praxi pro provedení měření termální stability pomocí spektrofotometru Agilent Cary 3500. White paper uvádí doporučení pro volbu kyvet, přípravu vzorku, nastavení parametrů měření i vyhodnocení dat. Zabývá se optimalizací experimentálních podmínek pro dosažení spolehlivých a reprodukovatelných výsledků a poskytuje tipy, jak předcházet artefaktům vzniklým kondenzací, odpařováním nebo bublinami.

Použitá metodika a instrumentace

Měření probíhá sledováním absorbance při 260 nm v závislosti na teplotě. Během zvyšování teploty dochází k narušení vodíkových vazeb mezi vlákny DNA/RNA, což se projeví nárůstem absorbance (hyperchromní efekt).

• Spektrofotometr: Agilent Cary 3500 UV-Vis s termokontrolou (Compact Peltier, Multicell Peltier nebo Multizone).
• Teplotní sondy Agilent in-cuvette probe pro přímé sledování teploty vzorku.
• Software Cary UV Workstation Thermal pro řízení tepelného programu, měření absorbance, vyhlazování dat a výpočet derivace.
• Kyvety z kvalitního křemene (cesty světla 10 mm, 3,5 mL) s možností použití kyvet s teplotní sondou nebo bez sondy, micro-/ultra-micro kyvety pro malé objemy.
• Stirring: hvězdicová míchátka Star (ø 9,5 mm).

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace parametrů měření ukazuje, že ideální šířka pásma spektra je 1–2 nm a doba průměrování signálu 2–3 s. Při řízení teploty sondou lze použít ramp rates až 40 °C/min; při kontrole přes blok se doporučuje ≤ 0,5 °C/min, aby teplota vzorku stíhala. Doplňkové kroky, jako předhřátí či vakuové odplynění, eliminují bublinové artefakty při vyšších teplotách. Kondenzaci lze omezit předehřátím kyvety a nitrogenovým purgem. Odpařování se redukuje použitím uzavřených či nízkoprostorových kyvet a mineral oil overlay.

Přínosy a praktické využití metody

Měření termální stability na Cary 3500 poskytuje rychlý screening stability nukleových kyselin, proteinů či polymerů. Metoda nachází uplatnění v biotechnologii, farmaceutickém výzkumu i QA/QC laboratořích. Díky možnosti paralelního měření více vzorků (Multicell, Multizone) se experimenty zrychlí a zajistí konzistentní podmínky. Přesná teplotní kontrola sondou zvyšuje reprodukovatelnost výsledků.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj měření termální stability lze očekávat ve formě automatizovaných workflow, integrace strojového učení pro analýzu křivek a kombinace s dalšími technikami (fluorescenční detekce). Rozšíření modulů pro mikrofluidní či high-throughput formáty umožní rychlejší charakterizaci velkých knihoven oligomerů a mutovaných sekvencí.

Závěr

Správná volba kyvety, příprava vzorku, nastavení měřicích parametrů a použití teplotní sondy vedou k vysoké kvalitě dat při termálních táních. Metoda je praktická pro široké spektrum biologických i materiálových studií, přináší rychlé výsledky a je plně kompatibilní s požadavky moderních laboratoří.

Reference

• 1. Mergny JL, Lacroix L. Analysis of thermal melting curves. Oligonucleotides. 2003;13(6):515–37.
• 2. Good NE, Izawa S. Hydrogen Ion Buffers. Methods Enzymol. 1972;24:53–68.
• 3. Good NE et al. Hydrogen Ion Buffers for Biological Research. Biochemistry. 1966;5(2):467–77.