Fluorescence measurement of hybridization between quencher (DABCYL) labelled PNA probes and a fluoresceine labelled DNA using the Fluorescence BioMelt Package

Význam tématu

• Reverzibilní hybridizace nukleových kyselin je klíčová pro buněčné procesy i diagnostické aplikace.
• PNA sondy díky neutrálnímu polyaminovému řetězci poskytují vyšší afinitu a stabilitu oproti DNA sondám.
• FRET založený na DABCYL/fluoresceinu umožňuje citlivé sledování denaturace a renaturace v reálném čase.

Cíle a přehled studie

Studie se zaměřuje na stanovení termálních destabilizačních teplot (Tm) pro dvě délky PNA sond (9mer a 13mer) označené kvenchrem DABCYL v komplexu s fluoresceinem značenou DNA. Cílem je porovnat jejich stabilitu a ověřit výhodnost delší sondy.

Použitá metodika a instrumentace

Ultrakompaktní Fluorescence BioMelt systém se skládá z:

• Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer
• Multicell Peltier s přesným řízením teploty
• Quartzové kyvety 10 mm
• Eclipse Thermal Software pro akvizici a termodynamické výpočty (ΔH, ΔS, ΔG)

Vzorky (50 nM PNA a DNA ve 100 mM NaCl, 10 mM KPO4, pH 7.1) byly skenovány v rozsahu 20–95 °C se zpětným rampováním a pětiminutovými stacionáry na krajních teplotách. FRET signál byl sledován při excitaci 495 nm a emisi 518 nm.

Hlavní výsledky a diskuse

• Tm hodnoty vypočtené derivační metodou:
  
  • 9mer PNA: 49,94 °C
  • 13mer PNA: 63,9 °C
• Delší PNA sonda díky vyššímu počtu polyaminových vazeb vykazuje vyšší teplotu denaturace, což potvrzuje silnější hybridizační afinitu.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá optimalizace hybridizačních podmínek bez nutnosti vícenásobných experimentů.
• Výběr sondy s požadovanou stabilitou pro PCR, diagnostiku nebo detekci mikroorganismů.
• Citlivé stanovení termodynamických parametrů pro návrh robustních analytických protokolů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na analýzu RNA, proteinových interakcí a vícenásobné značení fluorofory.
• In situ měření v komplexních biologických matricích a integrace s mikrofluidními systémy.
• Automatizace rampovacích protokolů pro vysokoprůchodové screenings.

Závěr

Použití Fluorescence BioMelt balíčku pro FRET termální melt přístupy umožnilo přesnou detekci Tm hodnot PNA/DNA komplexů. Výsledky ukazují, že délka PNA sondy významně ovlivňuje stabilitu hybridu, což napomáhá efektivní optimalizaci hybridizačních analýz v biotechnologii a diagnostice.

Reference

• Plum G.E., Pilch D.S., Singleton S.F., Breslauer K.J. Nucleic Acid Hybridization: Triple Stability and Energetics. Annu. Rev. Biomol. Struct. 1995, 24:319–350.
• Guzzo-Pernell N., Tregear G.W. Triple Helical DNA Analysis. Aust. J. Chem. 2000, 53:699–705.
• Guzzo-Pernell N., Lawlor J.M., Haralambidis J. Triple Helical DNA. Biomed. Peptides Proteins Nucleic Acids. 1997, 2:107–122.
• Yang M., Ghosh S.S., Millar P. Thermodynamics of DNATriple Helix Formation. Biochemistry. 1994, 33:15329–15337.
• Marky L.A., Breslauer K.J. Thermodynamic Data from Melting Curves. Biopolymers. 1987, 26:1601.