Characterization of Biomolecules using High-Performance UV-Vis Spectrophotometry

Význam tématu

UV-Vis spektroskopie patří mezi klíčové analytické metody pro charakterizaci biomolekul, zejména oligonukleotidů a proteinů. Poskytuje informace o koncentraci, čistotě, struktuře a stabilitě molekul, což je zásadní pro rozvoj diagnostiky, léků a biotechnologií.

Cíle a přehled studie / článku

Článek představuje technické vlastnosti Agilent Cary 3500 UV-Vis spektrofotometru a jeho využití při rychlém a spolehlivém zkoumání oligonukleotidů a proteinů. Autoři shrnují jeho aplikace v oblasti kvantifikace, termální stability, proteinových agregací, komparativních studií, enzymových kinetik a kontroly kvality biomolekul.

Použitá metodika

Metodika zahrnuje měření absorbance při 260 nm pro nukleotidy a 280 nm pro proteiny, analýzu kontaminantů pomocí poměrů 260/280 a 260/230, sledování enzymových reakcí kinetickými měřeními absorbance, termální tání biomolekul pomocí teplotních ramp a použití druhé derivace spekter k odhalení konformačních změn.

Použitá instrumentace

Hlavním přístrojem je Agilent Cary 3500 UV-Vis spektrofotometr s modulárními držáky Multicell (8 pozic) a Compact (2 pozice), vybavený Peltierovými bloky pro řízení teploty (0–110 °C) a xenonovou výbojkou s dlouhou životností. Analýzu a archivaci dat zabezpečuje software Agilent Cary UV Workstation s možnostmi technické kontroly dle FDA 21 CFR Part 11, EU Annex 11, GAMP5 a ISO/IEC 17025.

Hlavní výsledky a diskuse

Systém umožňuje simultánní měření až osmi vzorků, rychlé teplotní rampy (0,5–40 °C/min), vysokou opakovatelnost a práci s malými objemy (50 μl). Ukázalo se, že přístroj přesně detekuje degradaci, agregaci a konformační změny biomolekul při různých podmínkách pufrů, pH či přítomnosti denaturantů a excipientů.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí výraznou úsporu času díky paralelnímu měření, minimalizuje náklady na výměnu lampy, zkracuje dobu analýzy a zvyšuje reprodukovatelnost výsledků. Díky nízkému odběru vzorku, široké paletě vestavěných výpočtů a kompatibilitě s GMP normami je vhodná pro rutinní kontrolu kvality, výzkum i vývoj nových terapeutik.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj automatizace a integrace s mikrofluidikou, aplikace pokročilých algoritmů a umělé inteligence pro analýzu spektrálních dat, rozšíření využití ve víceomických studiích a výzkumu interakcí ve složitých biologických systémech.

Závěr

Agilent Cary 3500 UV-Vis spektrofotometr představuje efektivní nástroj pro charakterizaci biomolekul díky kombinaci vysoké rychlosti, flexibility, přesného řízení teploty a souladu s regulačními požadavky. Přispívá k zrychlení a zkvalitnění výzkumu i průmyslových aplikací.

Reference

• Lundin K. E. et al. Oligonucleotide Therapies: The Past and the Present. Hum. Gene Ther. 2015, 26(8), 475–485.
• Leader B. et al. Protein Therapeutics: A Summary and Pharmacological Classification. Nat. Rev. Drug Discov. 2008, 7, 21–39.
• Lai L. B. et al. Structural Basis for Impaired 5’ Processing of a Mutant tRNA Associated with Defects in Neuronal Homeostasis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2022, 119(10), e2119529119.
• Yang L. et al. Photoactivatable Circular Caged Oligonucleotides for Transcriptome In Vivo Analysis (TIVA). ChemPhotoChem. 2021, 5(10), 940–946.
• Pan X. et al. A Genetically Encoded Tool to Increase Cellular NADH/NAD+ Ratio in Living Cells. Nat. Chem. Biol. 2023 Oct 26.
• Kline M. C.; Duewer D. L. Evaluating Digital PCR for the Quantification of Human Nuclear DNA: Determining Target Strandedness. Anal. Bioanal. Chem. 2020, 412(19), 4749–4760.
• Riley M. B. et al. Structure and Activity of Native and Thiolated α-Chymotrypsin Adsorbed onto Gold Nanoparticles. Colloids Surf. B Biointerfaces 2022, 220, 112867.
• Raymond-Smiedy P. et al. A Spectrophotometric Turbidity Assay to Study Liquid-Liquid Phase Separation of UBQLN2 In Vitro. Methods Mol. Biol. 2023, 2551, 515–541.