FTIR Microscopic Imaging of Large Samples with 4x and 15x Infrared Objectives: A Case Study of a Carcinoma Tissue Section

Význam tématu

Fourierova transformace v infračervené mikroskopii (FTIR) představuje klíčový nástroj pro bezznačkovou chemickou analýzu biologických tkání. Umožňuje simultánní získání spektrálních dat z rozsáhlých ploch vzorku a nabízí neinvazivní přístup k identifikaci patologických změn v nádorových sekcích.

Cíle a přehled studie

Studie se zaměřuje na porovnání dvou objektivů (4× a 15×) pro FTIR mikroskopické zobrazování velkých vzorků. Modelovým objektem byla sekce laryngálního karcinomu o rozměrech přibližně 8×6 mm připravená na CaF2 podložce. Hlavním cílem bylo posoudit vliv zvětšení na velikost pole pohledu (FOV), prostorové rozlišení, dobu měření a kvalitu klasifikace tkáňových typů.

Použitá metodika a instrumentace

FTIR mikroskopie byla prováděna za pomoci Agilent Cary 620 mikroskopu spojeného se spektrometrem Agilent Cary 670. Detekce probíhala pomocí FPA detektoru o rozlišení 64×64 pixelů. Parametry měření:

• Spektrální rozlišení 4 cm⁻¹
• 16 akumulací signálu, 32 akumulací pozadí
• Under-sampling (UDR) nastaven na 4 (spektrální rozsah do 3975 cm⁻¹)
• 4× objektiv: FOV 1230×1230 µm, pixel 19,2×19,2 µm, mozaika 7×6 dlaždic
• 15× objektiv: FOV 350×350 µm, pixel 5,5×5,5 µm, mozaika 27×19 dlaždic

Pro zpracování velkých datových souborů (4,3 GB vs. 42,4 GB) byl využit Linuxový server s toolboxem hyperSpec v prostředí R. Spektra byla předzpracována včetně odečtu pozadí, baseline korekce a normalizace. Klasifikace pěti tkáňových typů (normální epitel, pojivo, zánět, dysplazie, karcinom/buňky krve) proběhla lineární diskriminační analýzou (LDA).

Hlavní výsledky a diskuse

FTIR obrazy obou konfigurací vykázaly srovnatelnou kvalitu spekter a dobrou homogenitu osvětlení. Použití 4× objektivu umožnilo až 3,4×3,4 větší FOV, zkrácení doby měření z 10:22 na 1:03 hodiny a zmenšení souboru na desetinu objemu. Nižší prostorové rozlišení (19 µm) však neumožňovalo detekovat detailní struktury, jako jsou krevní cévy s dutinou. Naopak 15× objektiv (5,5 µm) poskytl dostatečnou jemnost pro identifikaci drobných patologických změn. Spektrální analýza v oblasti 1200–1800 cm⁻¹ a LDA klasifikace prokázaly shodné rozložení tkáňových typů na celém vzorku.

Přínosy a praktické využití metody

FTIR mikroskopie s rozšířeným FOV je ideální pro rychlé průzkumné skeny velkých tkáňových oblastí. Volba mezi 4× a 15× objektivem závisí na požadovaném kompromisu mezi rychlostí sběru dat, velikostí souboru a prostorovým rozlišením. Metoda je vhodná pro klinické studií, farmaceutickou kontrolu či vývoj nových diagnostických přístupů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další zrychlení a zmenšení datových objemů lze dosáhnout instalací FPA detektoru 128×128 pixelů nebo vyššího UDR nastavení (např. UDR 8). V oblasti datového zpracování se očekává širší využití výkonných clusterů a strojového učení pro automatickou segmentaci a kvantifikaci biochemických struktur. Aplikace FTIR mikroskopie se dále rozšíří do personalizované medicíny a high-throughput screeningů.

Závěr

Studie prokázala, že rozšířený 4× IR objektiv výrazně zvyšuje efektivitu sběru dat pro komplexní tkáňové vzorky, zatímco klasický 15× objektiv zajišťuje vyšší citlivost a prostorové rozlišení pro detailní morfologickou analýzu. Kombinace obou přístupů nabízí flexibilní platformu pro pokročilé histochemické a fyzikálně-chemické studie.

Reference

• Beleites C., Popp J., Krafft C., Kansiz M. FTIR Microscopic Imaging of Large Samples with 4× and 15× Infrared Objectives: A Case Study of a Carcinoma Tissue Section. Agilent Technologies Application Note, 2014.