Imaging of Live Cells in Water Using an Agilent 620 FTIR Microscope and an Agilent Cary 670 FTIR System Equipped with Standard Thermal Source

Význam tématu

FTIR chemická zobrazovací technika umožňuje současnou detekci a kvantifikaci biomolekulárních složek s mikroskopickým prostorovým rozlišením přímo v živých buňkách ve vodném prostředí. Odstraňuje potřebu synchrotronových zdrojů, eliminuje artefakty způsobené dehydratací a otevírá cestu k monitorování dynamických biologických procesů v reálném čase.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat možnost zobrazovat živé řasové buňky Micrasteris hardyi v nativním vodném prostředí pomocí kompaktního FTIR systému Agilent Cary 670 spojeného s mikroskopem Agilent Cary 620. Autoři ukazují, jak lze bezsynchrotronově měřit chemické signály makromolekul a sledovat rozdíly mezi živými a prázdnými („ghost“) buňkami.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorku byla použita kapalinová buněčná komůrka se dvěma CaF2 okénky tloušťky 1 mm a 7µm teflonovým distančním rámečkem. Měření probíhala v přenosovém režimu:

• FTIR spektrometr Agilent Cary 670
• FTIR zobrazovací mikroskop Agilent Cary 620 s 15× objektivy (NA 0,62) a pracovní vzdáleností 21 mm
• FPA detektor 64×64 pixelů (4 096 spekter), pixel velikosti ~1,1 µm
• Spektrální rozlišení 8 cm–1, 256 akumulovaných skenů na dílčí snímek
• Mozaika 3×3 polí celkové velikosti ~210×210 µm za přibližně 1 hodinu (alternativa 128×128 FPA zkracuje čas na ~30 minut)

Hlavní výsledky a diskuse

Z FTIR spektroskopie byly získány obrazy rozložení makromolekulárních skupin:

• Obraz na základě C–H pásu (2 928 cm–1) odhaluje celkové organické komponenty
• Lipidový pás (1 713 cm–1) ukazuje inkluze lipidů, korelující s tmavými oblastmi na viditelném snímku
• Proteinový pás (1 640 cm–1) mapuje koncentraci proteinů
• Srovnání s pásy sacharidů (1 180–1 000 cm–1) diferencuje živé buňky a „ghost“ buňky vyprázdněné poškozením

Dosažená velikost pixelu 1,1 µm pracuje na difrakčním limitu (4–10 µm), což potvrzuje zobrazování i drobných struktur buňky. Všechny spektrální pásy od vodného pozadí jsou matematicky odstraněny.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje:

• Studium buněčných procesů in situ bez dehydratace
• Monitorování dělení buněk, buněčné odpovědi na teplotu, salinitu či chemické látky
• Šetření nákladů a času oproti synchrotronovým zdrojům
• Vyšší dostupnost FTIR zobrazování v biologických laboratořích

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje:

• Vyšší rozlišení a rychlejší akvizice díky pokročilým FPA detektorům
• Automatizace a vysokopropustné zobrazování pro farmaceutické a biotechnologické aplikace
• Integrace s mikrofluidickými systémy pro dynamické sledování reakcí
• Pokročilé spektrální zpracování a strojové učení pro lepší kvantifikaci biomolekul

Závěr

Studie prokázala poprvé možnost FTIR chemického zobrazování živých buněk v nativním vodném prostředí pomocí benchtop systému Agilent bez nutnosti synchrotronového zdroje. Metoda zachovává buněčnou chemii a otevírá nové směry v biologickém výzkumu.

Reference

• Kansiz M., Rein A. Imaging of Live Cells in Water Using an Agilent 620 FTIR Microscope and an Agilent Cary 670 FTIR System, Application Note 5991-6977EN, Agilent Technologies, 2016.