End-To-End Workflow Solutions for Short Nucleic Acids and mRNA Analysis

Význam tématu

Krátké syntetické oligonukleotidy a mRNA představují klíčové komponenty moderní genové terapie a vakcínového výzkumu. Jejich úspěšné nasazení v medicíně, například v RNA interferenci či mRNA vakcínách proti COVID-19, vyžaduje precizní analytickou kontrolu kvality s ohledem na velikost, čistotu, termodynamické parametry a strukturní modifikace (5’ capping, 3’ poly(A)).

Cíle a přehled studie

Cílem průvodce je představit end-to-end workflow pro analýzu krátkých nukleových kyselin a mRNA od fáze výzkumu až po kontrolu kvality a výrobu. Dokument shrnuje tři hlavní postupy zaměřené na:

• capilární elektroforézu krátkých oligonukleotidů,
• posouzení čistoty a koncentrace mRNA pomocí CE a UV-Vis spektroskopie,
• vyhodnocení míry 5’ cappingu a délky 3’ poly(A) pomocí LC/MS.

Použitá metodika a instrumentace

• Capilární elektroforéza s denaturačními gely pro oddělení podle velikosti (Agilent Fragment Analyzer, Oligo Pro II).
• UV-Vis spektrofotometrie pro kvantifikaci a detekci kontaminantů (Agilent Cary 3500, BioTek Synergy H1).
• Fluorometrické multimodální měření v mikrodestičkách pro vysokou propustnost (BioTek Take3, až 384 jamky).
• LC/MS workflow pro analýzu 5’ cappingu (RNase-H štěpení, AdvanceBio Oligonucleotide Columns, 1290 Infinity II Bio LC, 6545XT LC/Q-TOF).
• Digestion RNase T1 a obohacení poly(A) pomocí oligo-dT magnetických kuliček pro stanovení délky poly(A).

Hlavní výsledky a diskuse

• Vysoce rozlišené oddělení krátkých RNA a ssDNA s detekcí založenou na UV absorbanci bez potřeby barviv.
• Možnost sledovat QC parametry mRNA vakcín v různých fázích in vitro transkripce.
• LC/MS poskytuje přesné údaje o poměru kapovaných a nekapovaných molekul a variabilitě poly(A).
• Automatizace a propustnost systémů (až 96 vzorků bez zásahu uživatele) redukuje čas a riziko chyb.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlé a robustní QC workflow pro biotechnologický a farmaceutický průmysl.
• Optimalizace izolace, purifikace a přípravy vzorků malých RNA a mRNA.
• Podpora rozhodovacích procesů ve vývoji genových terapií a mRNA vakcín.
• Redukce nákladů a minimalizace chyb v sériové výrobě a kontrole kvality.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace AI pro automatizovanou analýzu dat a predikci kvality vzorků.
• Rozvoj miniaturizovaných zařízení a on-site QC systémů pro rychlé testování.
• Adaptace metod na nové modifikované nukleové kyseliny a nanostrukturální biologii.
• Vyšší propustnost díky paralelním kapilárám a mikrofluidním platformám.

Závěr

Komplexní end-to-end workflow zahrnuje CE, UV-Vis a LC/MS metody pro detailní charakterizaci krátkých oligonukleotidů a mRNA. Představená řešení poskytují vysokou přesnost, automatizaci a flexibilitu, což usnadňuje zavádění robustní QC praxe od vývoje až po výrobu.

Reference

• Agilent Technologies. Comparison of Small RNA Analysis using the Agilent Bioanalyzer and Agilent Fragment Analyzer Systems; technical overview; 2022; publication 5994-4860EN.
• Agilent Technologies. Performance Characteristics of the Agilent Oligo Pro II System; technical overview; 2021; publication 5994-3667EN.
• Agilent Technologies. Nucleic Acid Analysis for Sample Quality Assessment Using the Agilent Fragment Analyzer Systems; application compendium; 2022; publication 5994-2813EN.
• Agilent Technologies. Single-Guide RNA Quality Assessment with the Agilent 5200 Fragment Analyzer System; application note; 2019; publication 5994-0523EN.
• Agilent Technologies. Best Practices for Analysis of IVT mRNA Using the Agilent Fragment Analyzer Systems; technical overview; 2023; publication 5994-6568EN.
• Agilent Technologies. Best Practices for Analysis of In Vitro Transcribed (IVT) mRNA Using the Agilent Fragment Analyzer Systems; technical overview; 2023; publication 5994-5927EN.
• Agilent Technologies. Quality Control in IVT RNA Workflow using Agilent TapeStation Systems; technical overview; 2022; publication 5994-4882EN.
• Agilent Technologies. Rapid Analysis of mRNA 5' Capping with High Resolution LC/MS; application note; 2021; publication 5991-3984EN.