Complementary LC/MS and UV‑Vis Spectrophotometry for siRNA Quality Control and Thermal Stability Assessment

Význam tématu

Malé interferující RNA (siRNA) jsou rychle se rozvíjející třída terapeutických molekul. Pro vývoj, formulaci a rutinní kontrolu kvality je klíčové přesné stanovení integrity duplexu, identifikace jednotlivých řetězců a kvantifikace tepelné stability. Kombinace ion‑pair reverzní fáze LC/MS a UV‑Vis teplotních „melt“ (Tm) analýz poskytuje ortogonální přístup, který zvyšuje spolehlivost rozhodnutí v preklinickém a klinickém vývoji léčiv založených na siRNA.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo demonstrovat integrovaný analytický workflow spojující IP‑RP LC/MS a UV‑Vis Tm měření pro komplexní charakterizaci jednoho inklisiranového siRNA duplexu. Hlavními úkoly bylo: potvrdit hmotnosti jednotlivých sense (SS) a antisense (AS) řetězců i intactního duplexu, určit chromatografické podmínky, které udržují duplex v netdenaturovaném stavu, a porovnat teplotní stabilitu v biologickém pufru (PBS) versus v běžném LC elučním pufru obsahujícím organické složky.

Použitá instrumentace

Hlavní přístroje a spotřební materiál použitý ve studii:

• Agilent 1290 Infinity II Bio LC System (pumpa, autosampler, multicolumn thermostat, VWD).
• Agilent InfinityLab Pro iQ Plus mass detector (Agilent JetStream ESI, negativní ionizace).
• Kolona Altura Oligo HPH‑C18, 2.1 × 50 mm, 2.7 μm.
• Agilent Cary 3500 Multicell UV‑Vis Spectrophotometer s inkubetou a teplotním čidlem; Agilent quartz semimicro cuvettes (800 µL, 10 mm).
• Software: Agilent OpenLab CDS (v2.8) pro LC/MS a Agilent Cary UV Workstation (v1.6) pro Tm analýzy; dekonvoluční nástroje OpenLab pro interpretaci překrývajících se nabitých stavů.

Použitá metodika

Vzorce: inklisiran SS a AS dodané jako jednotlivé řetězce a duplex, rozpuštěné v RNase‑free vodě; koncentrace pro LC/MS ~10 pmol/µL, pro UV‑Vis ≈20 µg/mL.

Chromatografie: IP‑RP metodika se solventy založenými na 15 mM triethylaminu (TEA) a 100 mM HFIP ve vodě (solvent A) a směsí solvent A : methanol (50:50) jako solvent B. Průtok 0.5 mL/min, kolona temperována v rozsahu 30–60 °C, gradient z 10 % na 70 % B během 10 minut; injekční objem 2 µL.

MS akvizice: negativní polarita, skenování m/z 700–3000 v profiler módu, použití JetStream ESI, parametry zdroje upraveny pro oligonukleotidy; následná dekonvoluce spekter pro přesné určení molekulových hmotností.

UV‑Vis Tm měření: měření při 260 nm, teplotní rampa 25→90 °C při 5 °C/min, data zaznamenána každých 0.5 °C, měření provedena v trojím opakování; porovnání PBS (fiziologický pufr) versus LC eluční pufr (15 mM TEA, 100 mM HFIP + 25 % methanol). Mineralový olej minimalizoval odpařování v cuvetě.

Hlavní výsledky a diskuse

Chromatografie a vliv teploty:

• Při koloniích 30–40 °C byla duplexová forma zachována a AS, SS a duplex se baseline separovaly. SS elutoval později než AS kvůli konjugaci GalNAc, která zvyšuje hydrofobnost.
• Začátek denaturace se projevil mezi 40 a 50 °C; při 60 °C byl duplex prakticky zcela denaturován na jednotlivé řetězce. Vyšší teploty zkracují retenci vlivem snížené viskozity a lepší hmotové přenosu.

MS identifikace a dekonvoluce:

• Spectrum siRNA obsahovalo signály z AS, SS i intactního duplexu; překrývající se nabitostní stavy a addukty činily spektrum komplexním.
• Po dekonvoluci naměřené molekulové hmotnosti odpovídaly teoretickým hodnotám s odchylkou < ~2 Da: SS teoreticky ~8642.5 Da, pozorováno 8641.14 Da; AS teoreticky ~7699.6 Da, pozorováno 7697.79 Da; duplex ~16.34 kDa (odpovídající součtu).
• OpenLab dekonvoluční algoritmy úspěšně rozlišily překrývající se svazky a aduktové formy, což umožnilo spolehlivé potvrzení identity komponent.

UV‑Vis Tm výsledky:

• Tm v PBS: průměr 82.5 °C (velmi stabilní duplex v fysiologickém prostředí).
• Tm v LC elučním pufru (TEA/HFIP + 25 % methanol): průměr 46.8 °C — výrazné snížení stability způsobené organickým podílem a ion‑pair složením mobilní fáze.
• Rozdíl Tm potvrzuje, že kompozice pufru silně ovlivňuje konformaci a termickou stabilitu siRNA; výsledky UV‑Vis byly korelovány s chováním na LC, kde organická složka/převod k vyšší teplotě vedly k denaturaci.

Přínosy a praktické využití metody

Integrace IP‑RP LC/MS a UV‑Vis Tm poskytuje kompletní analytický balík vhodný pro:

• Potvrzení identity a čistoty oligonukleotidů (QC a release testy).
• Optimalizaci chromatografických podmínek, které zachovávají duplex během analýzy.
• Rychlou komparativní evaluaci formulací a mobilních fází z hlediska podpory konformace duplexu.
• Podporu vývoje a porovnávacích studií (stability, formulace, změny v sekvenci/chemických modifikacích).

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje a aplikace v oblasti analytiky siRNA:

• Rozšíření „native“ MS metodik a jemnější kontroly kondicí ionizace pro přímé měření intactních duplexů bez denaturace.
• Použití ion‑mobility spektrometrie pro rozlišení konformačních izomerů a aduktových forem.
• Automatizace Tm a LC/MS workflow pro vyšší propustnost v průmyslových QC laboratořích.
• Vyšší důraz na validaci metod pro regulační prostředí a vytvoření jednotných akceptačních limitů pro oligonukleotidové hmotnosti a Tm hodnoty.
• Formulační výzkum zaměřený na stabilizaci duplexu v přítomnosti organických rozpouštědel a při dlouhodobém skladování.

Závěr

Studie ukazuje, že kombinace IP‑RP LC/MS (analýza za netdenatujících i denatujících podmínek) a UV‑Vis Tm měření tvoří robustní a komplementární platformu pro charakterizaci siRNA. LC/MS poskytuje přesnou identifikaci a potvrzení hmotností jednotlivých komponent, zatímco UV‑Vis odhalí citlivost termické stability na složení pufru a organický obsah. Takový integrovaný přístup je vhodný pro vývoj, porovnávaní a rutinní QC terapeutických siRNA přípravků.

Reference

1. Gilar M.; Redstone S.; Gomes A. Impact of mobile and stationary phases on siRNA duplex stability in liquid chromatography. Journal of Chromatography A. 2024, 1733, 465285.
2. Huang T. Y.; Liu J.; Liang X. R.; Hodges B. D. M.; McLuckey S. A. Collision-Induced Dissociation of Intact Duplex and Single-Stranded siRNA Anions. Analytical Chemistry. 2008, 80(22), 8501–8508.
3. Berezhnoy A.; Brenneman R.; Bajgelman M.; Seales D.; Gilboa E. Thermal stability of siRNA modulates aptamer‑conjugated siRNA inhibition. Molecular Therapy — Nucleic Acids. 2012, 1, e51.
4. Agilent Technologies. Interview: Evaluating an Innovative Analytical ID Testing Strategy for Oligonucleotides. Agilent Technologies case study, publication number 5994-5144EN, 2022.