Study of Protein Conformation with FT-IR

Význam tématu

FT-IR spektroskopie představuje citlivou a rychlou metodu pro sledování sekundární struktury proteinů a jejich konformačních změn. Díky charakteristickému amide-I pásu umožňuje detekci přechodů mezi α-helixou, β-skládaným listem a náhodnou smyčkou, a to i v raných fázích denaturace nebo fibrilace.

Cíle a přehled studie

Application Note AN B404 popisuje princip FT-IR analýzy proteinové conformace a ukazuje praktické využití systému CONFOCHECK založeného na platformě Bruker INVENIO. Dokument shrnuje možnosti sledování:

• změn sekundární struktury při změnách teploty, pH nebo koncentrace solí,
• agregačních a fibrilačních procesů,
• konformace proteinů na nano- či mikročástečkách,
• účinku vazby nízkomolekulárních ligandů.

Použitá metodika

FT-IR spektroskopie využívá excitačního účinku infračerveného záření na vibrační módy peptidových vazeb, zejména C=O protahovací vibrace (amide-I pás). Podle Lambert-Beerova zákona intenzita absorpčního pásu úměrně roste s koncentrací chromoforu. Posun a tvar amide-I pásu odráží typ sekundární struktury a její změny v závislosti na okolních podmínkách.

Použitá instrumentace

Systém CONFOCHECK je založen na FTIR spektrometru Bruker INVENIO vybaveném BioATR II kyvetou. Spektra se sbírají za 30 sekund a vyhodnocují se pomocí chemometrie (Partial Least Squares, neuronové sítě) vůči databázi spekter referenčních proteinů.

Hlavní výsledky a diskuse

Ve studii byly demonstrovány následující aplikace:

• Termálně indukované unfolding RNázy A: postupný posun amide-I pásu prokázal denaturaci již od 40 °C s detailním zobrazením refoldingové kinetiky.
• Solí indukované unfolding: dialýza RNázy A s thiokyanátem vedla k koncentraci-závislým změnám pásu amide-I.
• Monitorování fibrilace: sledování antiparalelních β-struktur v reálném čase při vzniku agregátů relevantních pro neurodegenerativní onemocnění.
• Analýza proteinů na nanočásticích: potvrzení zachování konformace imobilizovaných proteinů a vlivu pH a ligandů na jejich strukturu.
• Studium protein-ligand vazby: detekce konformačních změn v cílovém proteinu po navázání látky.

Přínosy a praktické využití metody

FT-IR umožňuje:

• časné odhalení nestability proteinových formulací ještě před vznikem agregátů,
• optimalizaci podmínek skladování a lyofilizace léčivých proteinů,
• sledování kinetiky a mechanismu fibrilace s vysokou citlivostí,
• analýzu interakcí protein-povrch bez omezení světelného rozptylu,
• hodnocení vlivu ligandů na conformaci přímo v roztoku i na pevných nosičích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj FT-IR v proteomice a kvalitativní kontrole lze očekávat v oblasti:

• miniaturizace a automatizace měřicích buněk,
• integrovaných microfluidních systémů s in-line detekcí,
• pokročilých chemometrických algoritmů pro predikci dynamiky proteinových komplexů,
• petri‐dish a mikrotitračních formátů pro vysokopropustná měření.

Závěr

FT-IR spektroskopie je všestranný nástroj pro analýzu sekundární struktury a konformace proteinů v širokém spektru aplikací od vývoje farmaceutických formulací až po studie agregace relevantní pro biomedicínu. Systém CONFOCHECK poskytuje rychlá, citlivá a kvantitativní měření s minimální přípravou vzorků.