Protein Secondary Structure Estimation Using the Agilent Cary 630 FTIR Spectrometer

Význam tématu

Proteiny vykazují rozmanité biologické funkce, které jsou přímo spjaty s jejich sekundární strukturou. FTIR spektroskopie umožňuje rychlou a univerzální detekci sekundární struktury v roztoku s minimálními omezeními vzorku. Tento přístup doplňuje tradiční metody jako CD a rentgenovou krystalografii.

Cíle a přehled studie

Studie si klade za cíl demonstrovat použití Agilent Cary 630 FTIR spektrometru s ATR modulkem a softwaru MicroLab Expert pro rychlé odhadnutí sekundární struktury bílkovin v roztoku. Výsledky jsou porovnávány s literárními údaji získanými rentgenovou krystalografií.

Použitá metodika a instrumentace

• Spektrometrie FTIR s přenosovou technologií ATR Agilent Cary 630 se single reflection diamantovým modulem
• Spektrometrické parametry: spektrální rozsah 4000-650 cm-1, 140 skenů, rozlišení 4 cm-1, trojúhelníková apodizace, Mertzova fázová korekce
• Vzorky: BSA, lysozym, papain, β-casein, myoglobin a monoklonální protilátka připravené v čisté vodě a koncentrace 10-25 mg/mL
• Příprava dat: odečtení spektra vody, průměr tří měření, sloučení dat, vyhlazení Savitzky Golay filtrem, výpočet druhé derivace a křivkové fitování pro amide I pás

Hlavní výsledky a diskuse

Odhad sekundární struktury pro šest vzorků ukázal dobrý souhlas s hodnotami z literatury. Lysozym vykázal ~44% α-helixu a 19% β-skládaného listu, immunoglobulin G měl ~67% β-skládaného listu, myoglobin ~72% α-helixu, BSA a papain vykázaly smíšené složení a β-casein dominanci neuspořádaných struktur. Nižší obsah helixu u BSA v roztoku poukazuje na vliv prostředí na stabilitu proteinů.

Přínosy a praktické využití metody

• Okamžitá analýza sekundární struktury v roztoku bez nutnosti krystalizace
• Minimální spotřeba vzorku a snadná příprava
• Univerzální aplikace pro různé proteiny, včetně viskózních a vysoce koncentrovaných vzorků
• Vhodné pro rychlé screeningy a kontrolu kvality

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace a vysokopropustné analýzy proteinových knihoven
• Online monitorování strukturálních změn během výroby nebo skladování
• Integrace s chemometrickými a strojového učení pro detailní charakterizaci
• Rozšíření na komplexní biologické vzorky a formulace

Závěr

Metoda FTIR ATR s Agilent Cary 630 a softwarovým nástrojem MicroLab Expert umožňuje rychlé a spolehlivé odhadnutí sekundární struktury proteinů v roztoku. Výsledky jsou v souladu s referenčními daty z rentgenové krystalografie a poskytují efektivní nástroj pro biochemický a farmaceutický výzkum.

Reference

1. Barth A Biochim Biophys Acta 2007 1767 1073-1101
2. Greenfield NJ Nat Protoc 2006 1 2876-2890
3. Shi Y Cell 2014 159 995-1014
4. Jackson M Mantsch HH Crit Rev Biochem Mol Biol 1995 30 95-120
5. Levitt M Greer J J Mol Biol 1977 114 181-239
6. Kamphuis IG J Mol Biol 1984 179 233-256
7. Majorek KA Mol Immunol 2012 52 174-182
8. Barreto MSC Sci Rep 2020 10 13441
9. Abrosimova KV J Phys Conf Ser 2016 769