Evaluation of Amyloid-β Aggregation by Fourier Transform Infrared Spectrophotometer (FTIR)

Význam tématu

Amyloid-β hraje klíčovou roli v patogenezi Alzheimerovy choroby a dalších neurodegenerativních onemocnění díky schopnosti tvořit fibrilární agregáty se strukturovanými β‐listy. Analýza těchto procesů je zásadní pro porozumění mechanismu vzniku amyloidních plaku a pro vývoj terapeutických přístupů zaměřených na inhibici agregace.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie je sledovat časový vývoj agregace amyloid-β peptidu pomocí Fourierovy transformace infračervené spektroskopie (FTIR) a analýzy amide I pásu. Studie přináší podrobný popis přípravy vzorku, měřicích podmínek, derivativní analýzu spektra a kvantitativní rozklad sekundárních struktur peptidu.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Rozpouštění amyloid-β (1–40) v ultrapure vodě do koncentrace ~10 µM
• Odsrážení 60 µL roztoku na ATR krystalu (30 µL × 2) a odstranění zbytkové vody suchým vzduchem
• Měření v intervalu 0,5, 1, 2, 3, 24, 48 a 120 hod při 25 °C
• Spektrální rozsah amide I pásu (1 750–1 575 cm⁻¹), rozlišení 4 cm⁻¹, 100 akumulací
• Analýza druhé derivace spektra pro detekci negativních vrcholů (1 700–1 600 cm⁻¹)
• Křivkové fitování pomocí Lorentzovy funkce pro určení pozice, intenzity a šířky jednotlivých komponent

Instrumentace:

• FTIR spektrometr: Shimadzu IRTracer™-100
• ATR příslušenství: MicromATR™ s devíti­násobným odrazem (Czitek, LLC.)
• Detektor: DLATGS
• Apodizační funkce: čtvercovo-trojúhelníková

Hlavní výsledky a diskuse

Spektrální analýza ukázala posun hlavního vrcholu amide I pásu ze 1 626 cm⁻¹ po 0,5 h na 1 630 cm⁻¹ po 120 h, což odpovídá postupnému přechodu z antiparalelních β‐listů na paralelní β‐listy. Druhá derivace potvrdila útlum vrcholů charakteristických pro antiparalelní strukturu (1 696 a 1 626 cm⁻¹) a nárůst signálu pro paralelní strukturu (1 630 cm⁻¹). Kvantitativní rozklad spektra ukázal snížení poměru oblasti vysokého vlnového čísla (1 700–1 690 cm⁻¹) k oblasti nízkého vlnového čísla (1 645–1 615 cm⁻¹) z 0,2836 na 0,1860, což potvrzuje rostoucí převahu paralelních β‐listů a tvorbu fibril.

Přínosy a praktické využití metody

FTIR s ATR příslušenstvím umožňuje rychlou a citlivou analýzu sekundární struktury proteinů bez složité přípravy transmission buněk. Metoda je vhodná pro sledování kinetiky agregace, validaci in vitro modelů a screening inhibitorů amyloid-β fibrilace.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření metody o časově rozlišené spektroskopické techniky (2D-IR) pro detailní popis přechodných stavů
• Integrace s mikroskopickou technikou pro korelaci strukturálních změn a morfologie agregátů
• Vývoj automatizovaných systémů pro vysokopropustnou analýzu proteinové mechaniky

Závěr

FTIR-ATR analýza amide I pásu přinesla kvantitativní důkazy transformace sekundární struktury amyloid-β z antiparalelních na paralelní β-listy během agregace. Metoda představuje efektivní nástroj pro sledování proteinových agregací a má široké uplatnění ve výzkumu neurodegenerativních onemocnění.

Reference

1. Moran SD, Zanni MT. J. Phys. Chem. Lett. 2014, 5, 1984–1993
2. Tasumi M. Infrared Spectroscopy – Fundamentals and Recent Techniques. ST Japan, 2000
3. Kong J, Yu S. Acta Biochim. Biophys. Sin. 2007, 39(8), 549–559
4. Fezoui Y. Amyloid: Int. J. Chin. Invest. 2000, 7, 166–178
5. Sarroukh R, Goormaghtigh E, Ruysschaert JM, Raussens V. Biochim. Biophys. Acta 2013, 1828, 2328–2338
6. Kovacs-Nolan J. J. Agric. Food Chem. 2005, 53, 8421–8431