Protein Glycosylation Analysis Using the Agilent Cary 630 FTIR Spectrometer

Význam tématu

Glykozylace představuje klíčovou posttranslační úpravu terapeutických proteinů ovlivňující jejich stabilitu, účinnost a bezpečnost. Kontrola této kritické vlastnosti je nezbytná pro vývoj a výrobu biofarmaceutik.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat použití FTIR spektrometrie Agilent Cary 630 s ATR modulem pro rychlou identifikaci a kvantifikaci glykozylace v monoklonálních protilátkách a dalších glykoproteinech. Porovnaly se spektrální signály různých vzorků v oblasti glykanů.

Použitá metodika a instrumentace

Pro měření byla použita Agilent Cary 630 FTIR spektrometr vybavený single reflection diamond ATR modulem a software Agilent MicroLab Expert. Hlavní parametry:

• spektrometrický rozsah 4000–650 cm−1
• 140 skenů vzorku a 128 skenů pozadí
• rozlišení 2 cm−1
• apodizace trojúhelníková, technika měření Mertz ATR
• příprava vzorku: desaltace spin kolonkami, koncentrace 5 mg/ml, objem 15 µl

Hlavní výsledky a diskuse

Proteiny vykazují charakteristické amide I a II pásy, glykany absorbují v oblasti 1200–950 cm−1. Desaltace potlačuje interferenci excipientů. Integrace oblasti 1179–965 cm−1 koreluje s obsahem cukrů. Glykoproteiny vykazují různé intenzity podle úrovně glykozylace, cytochrom c bez glykozylace tuto oblast neabsorbuje. Deglykozylace enzymem PNGase F vedla k výraznému snížení glykanového signálu.

Přínosy a praktické využití metody

FTIR metoda nabízí rychlou, neteřivou analýzu s minimální přípravou vzorku. Umožňuje porovnávací hodnocení originálních a biosimilárních protilátek a sledování konzistence sérií během výroby.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření aplikací pro online monitorování glykozylace, integrace chemometrických metod, budování spektrálních databází a kombinace s hmotnostní spektrometrií pro detailní charakterizaci mikroheterogenity.

Závěr

Studie potvrdila, že Agilent Cary 630 FTIR je efektivním nástrojem pro rychlou a spolehlivou analýzu globálního glykanového profilu proteinů bez nutnosti složitého značení.

Reference

• He M Zhou X Wang X Glycosylation Mechanisms Biological Functions and Clinical Implications Signal Transduction Targeted Ther 2024 9(1) 194 DOI 10.1038/s41392-024-01886-12
• Derenne A Derfoufi KM Cowper B Delporte C Goormaghtigh E FTIR Spectroscopy as an Analytical Tool to Compare Glycosylation in Therapeutic Monoclonal Antibodies Anal Chim Acta 2020 1112 62–71 DOI 10.1016/j.aca.2020.03.028
• Khajehpour M Dashnau JL Vanderkooi JM Infrared Spectroscopy Used to Evaluate Glycosylation of Proteins Anal Biochem 2006 348(1) 40–48 DOI 10.1016/j.ab.2005.10.009
• Derenne A Derfoufi KM Cowper B Delport C Butré CI Goormaghtigh E Analysis of Glycoproteins by ATR-FTIR Spectroscopy Comparative Assessment Methods in Molecular Biology 2021 2271 361–374 DOI 10.1007/978-1-0716-1241-5_255
• Yang Y Wang G Song T Lebrilla CB Heck AJR Resolving the Micro-Heterogeneity and Structural Integrity of Monoclonal Antibodies by Hybrid Mass Spectrometric Approaches mAbs 2017 9(4) 638–645 DOI 10.1080/19420862.2017.1290033