Meet Big Tuna: automated, versatile buffer exchange

Shrnutí: Automatizovaná výměna pufrů Big Tuna

Význam tématu

Proces výměny pufrů je klíčový pro optimalizaci stability biologických léčiv. Správná volba pufru, pH, ionické síly nebo přídavných látek zásadně ovlivňuje konformační, chemickou i koligaciální stabilitu proteinů. Ruční metody jsou časově náročné, nepravidelné a obtížně škálovatelné při vysokém počtu vzorků. Automatizace tohoto kroku umožňuje zvýšit reprodukovatelnost, zvýšit průchodnost a výrazně snížit pracovní nároky laboratorního personálu.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikované studie bylo demonstrovat schopnosti platformy Big Tuna pro automatizovanou výměnu pufru a následnou koncentraci proteinů v různých objemových formátech. Studie zahrnovala vzorky lidského IgG připravené v poloprůtokových filtrech Unfilter 96 (100–450 μl) a Unfilter 24 (0,45–8 ml), přičemž bylo porovnáno několik režimů výměny: základní UF/DF, Filter & Refill a Dilute & Filter.

Použitá instrumentace

• Automatizovaný systém Big Tuna (Unchained Labs)
• Filtrační destičky Unfilter 96 a Unfilter 24 (10 kDa)
• Spektrofotometr Lunatic s aplikací A280 pro stanovení koncentrace

Použitá metodika

Proteinové vzorky (10–100 mg/ml IgG) byly pipetou naneseny do pufrem plněných jamek Unfilter destiček. Big Tuna pracuje na principu tlakové ultrafiltrace/diafiltrace s jemným orbitálním mícháním. Mezi cykly probíhá měření zbytkového objemu ultrazvukovým senzorem, na jehož základě je korigováno množství doplňovaného pufru a doba dalšího filtrování. Operátor může nastavit celkový podíl výměny (až 99 %) a procento objemové redukce za cyklus, stejně jako konečný objem po koncentraci.

Hlavní výsledky a diskuse

• Unfilter 96 (450 μl): dosažena výměna 96 % za 2,6 h při 3 cyklech; průměrná konečná koncentrace 10,4 ± 0,2 mg/ml a objem 457 ± 9 μl.
• Unfilter 96 + 3× koncentrace: konečná koncentrace 31,9 ± 2,5 mg/ml a objem 146 ± 5 μl za 3,5 h.
• Unfilter 24 (8 ml): výměna 97,7 % za 4,3 h; konečná koncentrace 10,9 ± 0,1 mg/ml a objem 8 001 ± 73 μl.
• Unfilter 24 + 3× koncentrace: koncentrace na 32,2 ± 0,5 mg/ml, objem 2 680 ± 15 μl za 4,4 h.
• Filter & Refill (4 ml, 99,6 mg/ml): 12 cyklů, 96 % výměna za 24,6 h, finální koncentrace 100,9 ± 1,6 mg/ml.
• Dilute & Filter (4 ml, 99,7 mg/ml): 5 cyklů, 96 % výměna za 11,4 h díky snížené viskozitě při 50 % ředění.

Porovnání režimů ukázalo, že při vysoké koncentraci je výhodné nejprve vzorek zředit (Dilute & Filter), což zkracuje celkový čas výměny i zátěž ultrafiltrační membrány.

Přínosy a praktické využití metody

• Vyšší průchodnost a konzistence napříč vzorky.
• Minimalizace manuálních úkonů a rizika kontaminace.
• Flexibilní nastavení výměnného režimu dle potřeby aplikace.
• Možnost simultánní výměny až 96 vzorků malého objemu nebo 24 vzorků velkého objemu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Automatizace výměny pufrů bude integrovat pokročilou analytiku a strojové učení pro optimalizaci parametrů v reálném čase. Dalším krokem je miniaturizace a plně robotizované procesy od přípravy vzorků po finální QC, což zvýší efektivitu vývoje terapeutik a výzkumu proteinů.

Závěr

Big Tuna představuje odborné řešení pro vysokopropustnou a spolehlivou výměnu pufrů a koncentraci proteinů. Díky proměnným režimům filtrování a zpětné náplně, přesnému objemovému řízení a automatizaci kroků významně zkracuje dobu analýz a zvyšuje kvalitu výsledků ve vývoji biologických léků.