DNA leaks before capsids pop: AAV thermal stability on Uncle

Význam tématu

Adeno-asociované viry (AAV) představují klíčové vektory pro genové terapie, kde je kritická stabilita virových částic, jejich genomů i proteinového obalu. Tradiční metody hodnocení stability (infekční testy, elektronová mikroskopie, ELISA, qPCR) jsou časově náročné, drahé a vyžadují velké množství vzorku. Platforma Uncle umožňuje integrované studium termální stability AAV v jednom experimentu s kombinací spektroskopických a světelně rozptylových technik, zkracuje dobu analýzy na méně než 2 hodiny a snižuje spotřebu vzorku na pouhých 9 µl.

Cíle a přehled studie

Cílem prezentované studie bylo demonstrovat schopnosti Uncle systému: sledovat dve hlavní dráhy degradace AAV při zahřívání (únik genomu a denaturace kapsidu), porovnat vliv koncentrace, serotypu a excipientů na stabilitu, měřit uvolněnou a celkovou DNA a stanovit počet virových částic pomocí DLS. Experimenty probíhaly pomocí aplikací Capsid Stability & DLS a Tm & Tagg s extrinzními barvivy a intrinsickou fluorescencí.

Použitá metodika a instrumentace

Uncle (Unchained Labs) – multifunkční stabilitní platforma s řízeným tepelným rampováním (15–95 °C) a třími detekčními módy: full-spectrum fluorescenční detekce (lasery 266 nm a 473 nm), statické SLS a dynamické DLS. Vzorky: AAV1, AAV2, AAV9 (5×10¹¹–1×10¹⁴ vg/mL) ve formulaci PBS s Pluronic F68 a případně 300 mM argininu. Barvivo SYBR Gold pro detekci DNA, měření 4×5 s akvizice DLS, objem 9 µl v křemenných kubetách, 0,5 °C/min rampování. Analýza dat v Uncle Analysis software (barycentrický střed spektra, Tagg, Tm, Tonset).

Hlavní výsledky a diskuse

• Detekovány dvě teplotní přechodové události: uvolnění genomu (Tm ≈57 °C pro AAV9) a denaturace kapsidových proteinů (Tm ≈78 °C), což potvrzuje nezávislost obou drah degradace.
• Koncentrace AAV9 v rozsahu 5×10¹¹–1×10¹³ vg/mL neovlivnila významně Tm uvolnění genomu, pouze intenzitu signálu.
• Různé serotypy vykazují odlišnou tepelnou stabilitu: AAV2 (Tm genomu ≈50 °C) je méně stabilní než AAV9 (Tm genomu ≈57 °C), shodně s rozdíly v Tm proteinové denaturace.
• Přidání argininu (300 mM) snižuje Tm uvolnění genomu o ~12 °C a mírně ovlivňuje Tm kapsidové denaturace, což naznačuje negativní vliv na konformační stabilitu.
• SLS i DLS prokázaly agregaci AAV po překročení Tagg (≈75 °C), DLS potvrdila mono­disperzitu při 29 nm před rampou a částicový počet byl kvantitativně stanoven pomocí kalibrační křivky (detekce od 5×10¹¹ vg/mL).
• Sérové měření volné DNA před rampou umožňuje detekci kontaminace a zbytkové buněčné DNA, zatímco měření po rampě umožňuje kvantifikaci uvolněné genomové DNA vůči standardům.

Přínosy a praktické využití metody

Uncle poskytuje komplexní pohled na stabilitu AAV ve stejném experimentu: simultánně sleduje uvolnění genomu, proteinovou denaturaci, agregaci, volnou a celkovou DNA i počet virových částic. Výsledkem je výrazně zrychlený screening formulací, serotypů a podmínek výroby s minimální spotřebou vzorku a plnou elektronickou stopou (21 CFR part 11).

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření aplikace na další virové vektory (lentiviry, adenoviry) a proteiny s komplexními povrchovými strukturami.
• Integrace s vysoce propustnými formáty a automatizovanými pipeline pro rychlý screening tisíců vzorků.
• Vyhodnocení vlivu dalších excipientů, pH a iontové síly na stabilitu, optimalizace formulací pro dlouhodobé skladování.
• Sloučení s funkcemi QC laboratoří pro standardizované validované analýzy virových produktů.

Závěr

Platforma Uncle nabízí efektivní, všestranný a citlivý přístup k analýze termální stability AAV, umožňující rychlé rozhodování o formulacích, serotypech a výrobních postupech v genových terapiích. Díky kombinaci fluorescenčních a světelně rozptylových technik na jediném přístroji se postup významně zkracuje a zjednodušuje, což usnadňuje přechod od výzkumu k průmyslové a klinické aplikaci.

Reference

• Bernaud J. et al. Characterization of AAV vector particle stability at the single-capsid level. Journal of Biological Physics 2018, 44(2):181–194.
• Horowitz E. et al. Biophysical and ultrastructural characterization of AAV capsid uncoating and genome release. Journal of Virology 2013, 87(6):2994–3002.
• Bennett A. et al. Thermal stability as a determinant of AAV serotype identity. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development 2017, 6:171–182.
• Wright J.F. Manufacturing and characterizing AAV-based vectors for use in clinical studies. Gene Therapy 2008.
• Wright J.F. et al. Identification of factors that contribute to recombinant AAV2 particle aggregation and methods to prevent its occurrence during vector purification and formulation. Molecular Therapy 2005, 12(1):171–178.