Have it all with protein quant & sizing on Stunner

Význam tématu

Rychlá a přesná kvantifikace bílkovin a stanovení jejich velikosti, hmotnosti a agregace je klíčové pro vývoj biologických léčiv i kontrolu kvality během výroby. Minimalizace odběru vzorku při zachování vysoké propustnosti analýzy zkracuje vývojové cykly a šetří vzácné materiály.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem dokumentu je představit platformu Stunner, která na objemu pouhých 2 µl vzorku poskytuje ve formátu 96 jamkové destičky za méně než 2 minuty komplexní údaje o koncentraci bílkoviny, její molekulové hmotnosti, počtu částic, hydrodynamickém průměru, polydisperzitě a agregaci. Studie demonstruje validaci metody na polystyrenových standardech, běžných proteinových standardech a modelových vzorcích monoklonální protilátky pod různými podmínkami agregace a tepelného stresu.

Použitá metodika a instrumentace

• Platforma: Stunner (Unchained Labs) kombinuje UV/Vis spektroskopii, otáčivé úhlové DLS (RADLS) a multiúhlové statické světelné rozptyl (MALS).
• Protokoly: Měření vzorků 2 µl bez nutnosti zředění, standardů či barviv; automatická optimalizace optiky pro přesné overlapy paprsku.
• Standardy: Polystyrenové kuličky 41 nm a 202 nm (NIST™ traceable, Thermo Fisher), proteiny BSA, konalbumin, IgG, ovalbumin, RNaseA (MilliporeSigma, Qiagen).
• Nastavení RADLS: 7 úhlů, 5 akvizic, 1 s každá; automatická eliminace odlehlých dat.
• Výpočet molekulové hmotnosti: extrapolace Rayleighova poměru R(θ) na R(0) pomocí Guinierova přímkového zobrazení a vzorce R(0)=K⋅c⋅M.

Hlavní výsledky a diskuse

• Velikostní standardy: Z-averagované průměry 41 a 202 nm s PDI<0,1, CV 2–3 %. Směs standardů 20:1 vykázala PDI>0,2, odrážející heterogenitu.
• Distribuce částic: Intenzitní, hmotnostní a početní profily odhalují reálné podíly malých a velkých částic, bez normalizace signálu.
• Kvantifikace proteinů UV/Vis: přesnost lepší než ±2 % vůči cílovým 5 mg/ml, CV<1 %.
• Molekulová hmotnost: stanovená hodnota pro pět proteinů v rozmezí od 14 do 150 kDa odpovídala referenčním údajům s odchylkou do 10 %.
• Detekce agregace: mAb1 se 0, 1 a 10 % agregátů ukázala konstantní hmotnostní koncentraci, pokles počtu částic a vznik druhé distribuce agregátů v intenzitních profilech.
• Stresový test teplem: po 10 minutách při ~80 °C došlo k přechodu hlavního píku DLS na větší rozměry, po 30 min. kompletní agregace, UV/Vis koncentrace beze změny.

Přínosy a praktické využití metody

Stunner umožňuje rychlé hloubkové profilování biologických vzorků v jediné analýze bez potřeby klasických standardních křivek či ředění. Díky kombinaci RADLS a MALS lze sledovat agregaci, kvantifikovat koncentraci i počty částic a stanovit molekulovou hmotnost při minimálním objemu vzorku a vysoké propustnosti.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace do automatizovaných vývojových linek pro on-line monitoring stability a agre- gace.
• Rozšíření aplikací na ostatní biomolekuly (virové částice, lipidové nanočástice, exozomy).
• Pokročilá softwarová analýza a umělá inteligence pro dekonvoluci komplexních směsí a časové řady degradace.
• Vývoj miniaturizovaných spotřebních destiček a mikrofluidních systémů pro ještě nižší spotřebu vzorku.

Závěr

Platforma Stunner přináší centralizované měření UV/Vis absorbance, RADLS a MALS na 2 µl vzorku během méně než 2 minut, což zásadně urychluje charakterizaci proteinů a nanočástic v průmyslové i akademické praxi. Vysoká přesnost, bezpotřebnost ředění či standardů a schopnost detekovat i kvantifikovat agregáty otevírají nové možnosti pro vývoj biologických léčiv, QC i výzkum stability.

Reference

Unchained Labs. Application Note: Have it all with protein quant & sizing on Stunner, Rev A, 2024.