Multi-day biologics stability experiments with Uncle

Význam tématu

Stabilita proteinů hraje klíčovou roli ve vývoji biologických léčiv. Klasická měření Tm a Tagg rychle řadí formulace, ale u podobných podmínek mohou být výsledky nerozlišitelné. Vícedenní izotermické testy poskytují podrobnější pohled na kinetiku unfolds a agregace za reálných podmínek dlouhodobé inkubace.

Cíle a přehled studie

Studie demonstruje využití platformy Uncle pro vícedenní izotermální testy stability a agregace lidského polyklonálního IgG. Cílem bylo porovnat teplotu tání (Tm), teplotu začátku agregace (Tagg) a kinetiku agregace při 58 °C po dobu 36 h ve formulacích s různými koncentracemi argininu.

Použitá metodika a instrumentace

• Instrumentace: Unchained Labs Uncle – měření intrinsické fluorescence (350/330 nm), statické světelné rozptylu (SLS) při 266 a 473 nm a dynamického světelného rozptylu (DLS); teplotní modul 15–95 °C; low-volume 48 vzorků najednou.
• Teplotní rampy 15–95 °C rychlostí 0,5 °C/min pro určení Tm (první derivace fluorescence) a Tagg (začátek SLS při 266 nm).
• Izotermická inkubace vzorků (1 mg/mL IgG) při 58 °C, sběr fluorescence a SLS spekter každých 10 min, DLS měření (4×5 s) každých 13 min po dobu 36 h.

Hlavní výsledky a diskuse

• Tm klesá od 66,5 °C v PBS po 59 °C při 250 mM argininu; Tagg roste až k 65 °C (100 mM Arg); u 250 mM Arg agregace prakticky nenastala.
• Izotermické SLS data (473 nm) ukázala nárůst a následný pokles signálu v PBS po 25 h (precipitace) vs. konstantní profil při 250 mM Arg.
• Fluorescenční poměr 350/330 nm postupně narůstal, přičemž arginin mírně destabilizoval počáteční konformaci proteinu.
• DLS ukázala nárůst hydrodynamického průměru z ~20 nm na >250 nm v PBS; u 250 mM Arg nárůst méně než dvojnásobný.
• Všechna měření prokázala vysokou reprodukovatelnost a možnost simultánního sledování stability, agregace a velikosti částic.

Přínosy a praktické využití metody

• Komplexní screening stability biologik v raných fázích vývoje.
• Rychlá identifikace optimálních excipientů (argininu) pro potlačení agregace.
• Úspora vzorku a času díky nízkým objemům a automatizaci.
• Integrované měření Tm, Tagg a size-profile v jediné analýze.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Screening dalších excipientů a komplexních formulací proteinů.
• Integrace s chromatografií či hmotnostní spektrometrií pro multidimenzionální charakterizaci stability.
• Využití strojového učení pro modelování a predikci stabilních formulací.
• Další automatizace a zvýšený throughput v préklinickém vývoji biologik.

Závěr

Platforma Uncle umožňuje komplexní hodnocení stability proteinů během dlouhodobých izotermických experimentů. Arginiová formulace významně omezuje agregaci a nárůst velikosti částic, což usnadňuje optimalizaci biologických léčiv.

Reference

1. Arakawa T. et al. Suppression of protein interactions by arginine: A proposed mechanism of the arginine effects. Biophysical Chemistry 127(1-2):1-8 (2007).
2. Ishibashi M. et al. Is arginine a protein-denaturant? Protein Expression and Purification 42(1):1-6 (2005).