Figure out aggregation early: simultaneous, independent measurements of B22 and kD on Uncle

Význam tématu

V oblasti biotechnologií se významně zvyšuje poptávka po vysokokoncentrovaných biologických léčivech, kde riziko vzniku agregátů může omezit účinnost a bezpečnost přípravku. Parametry difuzního interakčního koeficientu kD a druhého virialového koeficientu B22 umožňují včasnou predikci kolloidní stability a sklonu k agregaci bílkovin.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo ověřit schopnost platformy Uncle provádět nezávislá a současná měření kD a B22 na modelové bílkovině lysozymu v prostředí s nízkou (100 mM NaCl) a vysokou (400 mM NaCl) koncentrací soli. Studie porovnává získané hodnoty s publikovanými literárními daty a hodnotí věrohodnost výsledků.

Použitá metodika a instrumentace

Platforma Uncle umožňuje současné měření statického a dynamického rozptylu světla (SLS a DLS) až ve 48 vzorcích:

• Příprava lysozymu v acetátovém pufru (pH 5,2) s 100 nebo 400 mM NaCl.
• Řada koncentrací 5–25 mg/mL, třístupňová centrifugace a nanesení 9 µL vzorku ve trojím provedení.
• Měření DLS (4 akvizice po 5 s) pro výpočet difuzního koeficientu kD.
• Kalibrace SLS intenzity na standardu toluenu pro výpočet B22.

Hlavní výsledky a diskuse

Lysozym v nízké solí vykázal kladné hodnoty kD (+3,8 mL/g) a B22 (1,7×10^–4 mol·mL/g^2), což naznačuje repulzivní interakce a dobrou stabilitu. Naopak ve vysoké solí byly naměřeny záporné hodnoty kD (–6,0 mL/g) a B22 (–1,6×10^–4 mol·mL/g^2), odpovídající atraktivním interakcím vedoucím k reverzibilnímu shlukování. Získané výsledky se shodují s literaturou (kD 4,2/–5,7 mL/g; B22 3,9×10^–4/–2,0×10^–4) a vizuálními pozorováními zákalu roztoku.

Přínosy a praktické využití metody

Platforma Uncle poskytuje rychlé, úsporné a současné stanovení klíčových parametrů stability bílkovin s minimálním množstvím vzorku. To umožňuje výzkumným laboratořím i průmyslovým uživatelům:

• Rychlou selekci formulací s nízkým rizikem agregace.
• Snížení nároků na vzorek a čas experimentu.
• Efektivní porovnání kandidátů ve stadiu vývoje.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření vysokoprůchodových měření stability zahrnujících další biofyziologické parametry, automatizované datové analýzy včetně AI‐algoritmů a integrace s dalšími technikami (např. DSC, ITC). Vyšší propustnost metod přispěje k rychlejšímu vývoji a optimalizaci nových biologik.

Závěr

Jedním experimentem na platformě Uncle lze paralelně získat hodnoty kD i B22, které přesně odrážejí stabilitu lysozymu v různých solných podmínkách. Metoda je rychlá, vyžaduje nízké množství vzorku a poskytuje výsledky v souladu s publikovanými daty.

Reference

1. Shi S et al. Method qualification and application of diffusion interaction parameter and virial coefficient. International Journal of Biological Macromolecules 62(2013):487–493.