Assess aggregation risk at higher protein concentrations with G22

Význam tématu

V oblasti vývoje proteinových léčiv je klíčové minimalizovat riziko agregace, které může ohrozit účinnost a stabilitu terapeutických přípravků. Měření interakcí mezi molekulami bílkoviny umožňuje předpovědět chování roztoků při nízkých i vysokých koncentracích. Parametr G22, založený na integrálu Kirkwood–Buffovy teorie, zohledňuje efekty „crowdingu“ a je vhodný právě pro rozsah koncentrací typický pro biopharmaceutika (>10 mg/ml).

Cíle a přehled studie / článku

Cílem této technické poznámky bylo demonstrovat schopnost platformy Uncle (Unchained Labs) současně měřit parametry kD, B22 a G22 a porovnat jejich výpovědní hodnotu pro posouzení kolloidní stability bílkovin. Jako modelové proteiny byly použity alfa-chymotrypsinogen a humanizované monoklonální protilátky (adalimumab). Roztoky byly připraveny v rozdílných pufrovacích podmínkách a měřeny při sedmi koncentracích až do 100 mg/ml.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda byla založena na kombinaci statické a dynamické rozptylové spektroskopie (SLS/DLS) s fluorescenční detekcí. Zařízení Uncle využívá pouhých 9 µl vzorku a umožňuje současné měření až 48 vzorků. Kalibrace byla provedena s toluenem, proteiny se dialyzovaly a inhibitor tryp­sinu byl neutralizován PMSF. Pufry: 10 mM sodnocitrát pH 3,5, 5 mM fosfát pH 7, 40 mM acetát pH 5 ± 300 mM NaCl.

Hlavní výsledky a diskuse

Pro alfa-chymotrypsinogen v pufru pH 7 a v přítomnosti NaCl vykazoval parametr R90/K strmý vzestup, což odpovídá pozitivním G22 a net-atraktivním interakcím. V pufru acetát pH 5 bez soli byla zaznamenána negativní hodnota G22 při vyšších koncentracích, indikující repulzivní interakce. Přítomnost NaCl v acetátu snižuje repulzi a opět posouvá G22 do kladných hodnot. Sledované kD a B22 byly platné pouze pro řídší roztoky dle kritéria |c·B22·MW|<0,05. U adalimumabu (144 kDa) v komerční formulaci pH 5,2 byly v rozmezí 14–100 mg/ml vypočteny záporné hodnoty G22, potvrzující dobrou kolloidní stabilitu.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá charakterizace kolloidní stability proteinových formulací v jednom experimentu.
• Možnost volby mezi kD, B22 a G22 v závislosti na koncentraci.
• Minimální náročnost na spotřebu vzorku (9 µl).
• Simultánní sledování až 48 vzorků zvyšuje výtěžnost laboratoře.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se širší uplatnění parametrů interakce v kombinaci s počítačovým navrhováním mutací pro optimalizaci stability. Dále je reálné začlenění G22 do high-throughput screeningových platforem a rozšíření o další metody spektroskopie zajišťující komplexní profil stability biotherapeutik.

Závěr

Platforma Uncle umožňuje komplexní posouzení kolloidní stability proteinů napříč širokým rozsahem koncentrací. Díky současnému výpočtu parametrů kD, B22 a G22 získávají výzkumníci flexibilní nástroj pro optimalizaci formulací a minimalizaci rizika agregace u léčivých proteinů.

Reference

1. O’Brien CJ et al. Protein Engineering, Design & Selection 29(6):231–243 (2016).
2. Woldeyes MA et al. Journal of Physical Chemistry B 121:4756–4767 (2017).