Take a peek inside your AAV capsid with Stunner

Význam tématu

Správná kvantifikace titrů adeno-asociovaného viru (AAV) a určení poměru prázdných a plných kapsid má klíčový význam pro vývoj a výrobu genové terapie. Vzhledem k rostoucímu počtu klinických studií a průmyslové produkce AAV je nezbytné disponovat rychlými, spolehlivými a nákladově efektivními metodami analýzy s nízkou spotřebou vzorku.

Tradiční techniky jako analytická ultracentrifugace (AUC), transmisní elektronová mikroskopie (TEM), ELISA či PCR-based metody často vyžadují velké objemy vzorku, dlouhou dobu analýzy a náročnou optimalizaci pro každý serotyp.

Cíle a přehled studie

Cílem příspěvku je představit platformu Stunner, která kombinuje UV/Vis spektroskopii, statické a dynamické rozptylové metody (SLS a DLS) pro komplexní a rychlou charakterizaci AAV kapsid. Metoda umožňuje stanovit celkový titr kapsid, poměr prázdných a plných částic i míru agregace během cca jedné minuty s pouhými 2 µl vzorku a bez potřeby standardů nebo značení.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky AAV2, AAV5 a AAV9 (prázdné i naplněné konstrukty s GFP nebo LacZ) byly naředěny v pufrech PBS nebo citrate-phosphate s pluronickem F68. K odstranění volné DNA byly použity DNáza I a benzonáza. Pro kalibraci ssDNA titrů byla využita fluorescenční metoda SYBR Gold. Analýzy proběhly na přístroji Stunner obsahujícím:

• UV/Vis spektrofotometr – pro kvantifikaci celkového obsahu proteinů a nukleových kyselin
• Dynamický rozptyl světla (DLS) – pro určení velikostního rozdělení a přítomnosti agregátů
• Statický rozptyl světla (SLS) – pro kvantifikaci koncentrace částic

Hlavní výsledky a diskuse

1. Srovnání celkového titru kapsid se standardní ELISA metodou ukázalo vynikající kongruenci (R2 > 0,98).
2. Stanovení plného titru (encapsidované ssDNA) odpovídalo výsledkům SYBR Gold assay s minimální odchylkou.
3. Metoda přesně určovala procento plných a prázdných kapsid v sériích známých směsí (standardní odchylky < 5 %).
4. DLS umožnila snadné sledování agregace za různých skladovacích podmínek (4 °C, pH 7 vs pH 4) a po tepelné zátěži.
5. V porovnání zásaditých a kyselých pufrů metoda prokázala rozdílnou stabilitu AAV9 při 45 °C, což demonstrovalo možnosti širokého screeningu formulací.

Přínosy a praktické využití metody

• Extrémně nízký objem vzorku (2 µl) a krátká doba analýzy < 1 minuty na vzorek
• Bez nutnosti specifických standardů, protilátek či PCR primerů
• Rychlé vyhodnocení plného/prázdného poměru a míry agregace
• Vhodné pro výzkum, vývoj i rutinní QC v GMP
• Možnost automatizace a vysokopropustného formátu SBS destiček

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace do procesní analytické technologie (PAT) a on-line monitoringu výroby
• Rozšíření na další virové vektory a nanopartikuly
• Využití v screeningových studiích formulací a stabilizátorů
• Implementace plné validace podle farmakopeálních norem a 21 CFR Part 11

Závěr

Platforma Stunner představuje komplexní a rychlý nástroj pro kvantifikaci AAV kapsid, poskytuje přesné titry, poměr prázdných/plných částic a detekci agregace při minimální spotřebě vzorku. Metoda zkracuje dobu analýzy, eliminuje potřebu dodatečných reaktiv a zvyšuje efektivitu jak ve výzkumu, tak v průmyslové výrobě genových terapií.

Reference

1. Dobnik D. et al. Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors. Frontiers in Microbiology 2019, 10:1570.
2. Sommer JM. et al. Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement. Molecular Therapy 2003, 7(1):122–128.
3. Rodrigues G. et al. Pharmaceutical Development of AAV-Based Gene Therapy Products for the Eye. Pharmaceutical Research 2019, 36:29.