Process Raman as a comprehensive solution for downstream buffer workflow

Procesní Raman pro kvantifikaci excipientů v UF/DF: přehled aplikace

Význam tématu

Procesní (in-line) Ramanova spektroskopie nabízí specifickou, rychlou a neinvazivní metodu pro identifikaci a kvantifikaci molekul v aquózních fázích bez potřeby přípravy vzorku. V downstream biotechnologiích, zejména při zpracování mAb a nukleových kyselin, umožňuje Raman přímé sledování kritických parametrů procesu (CPP) v reálném čase, což zrychluje rozhodování, snižuje závislost na offline analýzách a zvyšuje robustnost výroby. Studie ilustruje aplikaci procesního Ramanu jako PAT nástroje pro monitorování excipientů během ultrafiltrace/diafiltrace (UF/DF) a pro hodnocení kvality pufrů před použitím.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem bylo demonstrovat schopnost procesního Ramanova analyzátoru kvantifikovat v reálném čase excipienty běžné ve formulacích mAb (L-histidin, L-arginin, sacharóza) během bench-scale UF/DF a zároveň ukázat možnosti detekce změn kvality pufrů (např. hydrolyza sacharózy). Studie použila experimentální Design (Uniform Design) k vytvoření kalibračních sad a aplikovala PLS chemometrické modely na data získaná in-line.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Design kalibračních vzorků: Uniform Design (DoE) s rozsahy L-histidin 0–15 mg/mL, L-arginin 0–40 mg/mL a sacharóza 0–200 mg/mL; do tréninkové sady byly přidány i spektra IgG1 (5–150 mg/mL) pro zlepšení robustnosti v matrici proteinu.
• Spektrální zpracování: spektrální rozsah 800–3235 cm⁻¹; normalizace pomocí infinity norm v oblasti 2900–3230 cm⁻¹; Savitzky–Golay filtr (1. derivace, polynom řádu 2, šířka okna 13); mean-centering; výběr latentních proměnných minimalizující overfitting pomocí LOOCV.
• Kvantifikace: Partial Least Squares (PLS) modely; validace zahrnula sedm nezávislých vzorků měřených na třech přístrojích.
• UF/DF provoz (bench-scale): PES membrána, vyrovnání v Tris pH 7.0, vstupní koncentrace IgG1 10 g/L, cílové zatížení 500 g/m²; UF feed rate 300 L/m²·h; TMP udržován 10–15 psi; diafiltrace manuálním přidáním bufferu při konstantním objemu.

Použitá instrumentace:

• Thermo Scientific MarqMetrix All-In-One Process Raman Analyzer
• Thermo Scientific MarqMetrix FlowCell Sampling Optic (in-line FlowCell)
• Thermo Scientific MarqMetrix BallProbe Sampling Optic (pro měření stability pufru)
• Parametry akvizice: laser 450 mW, integrační čas 3000 ms, průměr 3 spekter, celkový čas sběru ~18 s; při průtokovém testu rychlost 100 mL/min.

Hlavní výsledky a diskuse

- PLS modely pro L-histidin, L-arginin a sacharózu vykázaly vysokou korelaci mezi predikcí a referencí (R² kalibrace/CV ~0.99–1.00, R² predikce ≥0.98) a nízké chyby (RMSEC, RMSECV, RMSEP viz grafy). Modely byly přenositelné mezi třemi přístroji díky standardizačnímu zpracování spekter.

- Přesnost predikce na konci buffer exchange byla lepší než 5 % absolutní chyby; konkrétně: L-histidin 4.2 vs 4.1 g/L (1.0 %), L-arginin 7.0 vs 7.1 g/L (1.4 %), sacharóza 92.4 vs 95.6 g/L (3.4 %).

- Při monitoringu skladovaného pufru po dobu 15 dnů Raman detekoval pokles signálu sacharózy z ~86 mg/mL na ~57 mg/mL. Současně se objevily nové Ramanovy pásy odpovídající glukóze a fruktóze; HPLC potvrdila hydrolyzu sacharózy na glukózu a fruktózu. Toto doprovázelo pokles pH (~1 jednotka) a nárůst osmolality (~+40 %), indikující kyselou hydrolýzu.

- Model sacharózy nebyl trénován na spektrálních prvcích glukózy a fruktózy, což vedlo k nadhodnocení predikcí; autorky upozorňují, že rozšířením tréninkové sady o tyto produkty by se přesnost zvýšila.

- Monitorovací metriky PLS (snížený Hotelling T² vs redukovaný Q reziduál) ukázaly nárůst Q reziduálu s postupující hydrolyzou, což autoři navrhují využít jako kvalitativní kontrolní limit pro přijímání/odmítání pufru před použitím v UF/DF.

Přínosy a praktické využití metody

• Reálná časová kvantifikace excipientů umožňuje přesnější řízení diafiltrace (Vdf) než pouhé empirické nebo teoretické odhady, čímž se sniží riziko nedostatečné výměny pufru vlivem Gibbs–Donnanova efektu nebo jiných faktorů.
• Možnost současného monitoringu proteinu a excipientů v jednom měření zvyšuje efektivitu a otevírá cestu k automatizaci a multimodálnímu řízení UF/DF procesů.
• Detekce změn kvality pufru před jeho použitím může předejít selhání šarže a snížit náklady spojené s offline kontrolami a opakovanými běhy.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření kalibračních sad o rozkladné produkty (např. glukóza, fruktóza) a další excipienty pro zvýšení robustnosti modelů v reálných podmínkách.
• Integrace procesního Ramanu do regulačních uzavřených řídicích smyček pro automatizované řízení UF/DF na základě reálných dat (feedback/ feed-forward kontrola).
• Multisenzorové řešení kombinující Raman s dalšími inline senzory (pH, osmolalita, UV/Vis) pro komplexní dohled nad CPP a CQAs.
• Systematická studie vlivu změn matrix (různé proteiny, koncentrační rozsahy) a škálování z bench na pilot/produkční měřítko s ohledem na přenositelnost modelů.
• Adopce standardů a harmonizace validace modelů pro širší průmyslové přijetí a regulátorní akceptaci PAT Ramanu.

Závěr

Procesní Ramanova spektroskopie s MarqMetrix All-In-One analyzátorem a FlowCell/BallProbe sampling optikami byla schopna v reálném čase kvantifikovat L-histidin, L-arginin a sacharózu během UF/DF s absolutní chybou menší než 5 %. Metoda rovněž detekovala degradaci sacharózy (acidická hydrolyza) doprovázenou změnami pH a osmolality a umožnila identifikovat nárůst Q reziduálu jako ukazatele zhoršení kvality pufru. Tyto výsledky potvrzují potenciál procesního Ramanu jako PAT nástroje pro efektivní monitorování, řízení a potenciální automatizaci downstream procesů.

Reference

1. Zhang L.; Liang Y.-Z.; Jiang J.-H.; Yu R.-Q.; Fang K.-T. Uniform Design Applied to Nonlinear Multivariate Calibration by ANN. Analytica Chimica Acta 1998, 370, 65–77.
2. Choquette S. J.; Etz E. S.; Hurst W. S.; Blackburn D. H.; Leigh S. D. Relative Intensity Correction of Raman Spectrometers: NIST SRMs 2241–2243. Applied Spectroscopy 2007, 61, 117–129.
3. Torres A. P.; Oliveira F. a. r.; Silva C. l. m.; Fortuna S. p. The Influence of pH on the Kinetics of Acid Hydrolysis of Sucrose. Journal of Food Process Engineering 1994, 17, 191–208.
4. Wiercigroch E.; Szafraniec E.; Czamara K.; Pacia M. Z.; Majzner K.; Kochan K.; Kaczor A.; Barańska M.; Małek K. Raman and Infrared Spectroscopy of Carbohydrates: A Review. Spectrochimica Acta Part A 2017, 185, 317–335.
5. Kumar S.; Martin E. B.; Morris J. Detection of Process Model Change in PLS Based Performance Monitoring. IFAC Proceedings Volumes 2002, 35, 125–130.
6. Agrawal P.; Wilkstein K.; Guinn E.; Mason M.; Serrano Martinez C. I.; Saylae J. A Review of Tangential Flow Filtration: Process Development and Applications in the Pharmaceutical Industry. Organic Process Research & Development 2023, 27, 571–591.
7. Nolasco M.; Pleitt K.; Khadka N. Using a Process Raman Analyzer as an In-Line Tool for Accurate Protein Quantification in Downstream Processes.
8. Nolasco M.; Pleitt K.; Khadka N. Raman-Based Accurate Protein Quantification in a Matrix That Interferes with UV-Vis Measurement.