BioPharmaceutical approach with spectroscopy

Význam tématu

Spektrální techniky (FTIR, NIR, Raman a UV‑Vis) hrají v biotechnologické a biofarmaceutické výrobě rostoucí roli jako rychlé, necestné a často nedištruktivní analytické nástroje. Umožňují řízení jak vstupních surovin, tak průběhu procesu v reálném čase (PAT), zkracují čas potřebný pro laboratorní analýzy, snižují závislost na offline testování a zlepšují reprodukovatelnost a kvalitu biologických produktů. Kompendium předkládá soubor aplikací demonstrujících nasazení těchto technik v upstream i downstream částech výrobního řetězce — od identifikace surovin přes monitorování buněčných kultur až po konečnou kontrolu přípravků a přípravu k uvolnění.

Cíle a přehled studie / článku

• Prezentovat praktické aplikace FTIR, NIR, Raman a UV‑Vis spektroskopie v biopharma prostředí.
• Ukázat možnosti kvantifikace proteinů v buněčných kulturách (FT‑NIR), monitorování glukózy a laktátu v bioreaktorech pomocí in‑line Raman (PAT), a automatizace dávkování glukózy.
• Ilustrovat metodiky pro určení sekundární struktury proteinů (FTIR), detekci agregátů (UV‑Vis + integrující sféra), testování čistoty DNA a jejího vlivu na klonování (NanoDrop), a sledování změn plazmonické resonance u zlatých nanoshellů po biokonjugaci (UV‑Vis).
• Diskutovat přenositelnost chemometrických modelů mezi Raman přístroji (direct/global/correction) a vyhodnocení výkonnosti PLS modelů pro běžné analytické cíle.

Použitá metodika a instrumentace

• Spektrální techniky: FTIR (transmise a ATR), FT‑NIR, Raman (procesní a laboratorní), UV‑Vis (mikroobjemové i s integrující sférou).
• Detektory a příslušenství: MCT a DTGS detektory, ConcentratIR2 ATR, BioCell CaF2 buněčné okénko, Antaris MX FT‑NIR, MarqMetrix All‑In‑One Process Raman Analyzer, MarqMetrix BallProbe a FlowCell, DXR3 SmartRaman+, Automatic Sampling Array (ASA), OMNIC/PROTA‑3S/TQ Analyst/SOLO chemometrický SW, Thermo Scientific NanoDrop (One, Lite Plus, Eight/Ultra).
• Chemometrie: PLS regrese, diskriminantní analýza, VIP, Hotelling T², Q‑residua, LOOCV, předzpracování spekter (Savitzky‑Golay derivace, SNV, L1 norm, mean‑centering), normalizace a standardizace napříč přístroji.
• Specifické postupy: dekonvoluce amide I pásu (FTIR) pro odhad sekundární struktury; Kubelka‑Munk transformace a integrující sféra pro korekci rozptylu u zakalených proteinových vzorků; PLS modely pro glukózu/laktát (Raman) a pro excipienty v UF/DF procesu; A205 metoda pro přímou kvantifikaci proteinů v mikroobjemu (NanoDrop).

Hlavní výsledky a diskuse

• FTIR pro sekundární strukturu: Transmission a ATR FTIR s dekonvolucí amide I poskytly složení sekundární struktury v souladu s rentgenovými daty (příklady: cytochrom C, koncanavalin A, BSA). ATR je výhodné pro nízké množství vzorku; software PROTA‑3S/OMNIC poskytuje rychlou analýzu.
• Procesní Raman pro automatizaci glukózy: In‑line Raman + PLS modely udržely glukózu v cílovém rozmezí (4–7,5 g/L) s RMSEP ≈ 0.45–0.5 g/L pro glukózu a ≈0.24 g/L pro laktát. Implementovaná logika umožnila jednou denně dávkovat glukózu bez lidské intervence, srovnatelné títrem a kvalitou produktu oproti manuálnímu režimu.
• Přenos metod mezi Raman: Porovnání direct transfer, global (kalibrace zahrnující všechny přístroje) a correction (úprava výsledku pomocí několika korekčních spekter) ukázalo, že global poskytuje nejlepší přesnost, direct transfer je nejjednodušší, correction dává kompromis mezi náročností a výkonem. Výběr spektrální oblasti zásadně ovlivnil úspěšnost přenosu.
• NIR pro predikci proteinů v kulturách: FT‑NIR (Antaris MX) dokázal predikovat proteinové koncentrace v rozmezí 0.16–5.0 g/L s R≈0.977 a RMSEP ≈0.31 g/L, vhodné pro reálné procesní monitorování.
• UV‑Vis detekce agregátů: Agregující se proteiny způsobují spektrální artefakt rozptylu. Pro mírné rozptýlení stačí matematická korekce (λ⁻4), pro silně zakalené vzorky integrující sféra + Kubelka‑Munk transformace umožnila kvantifikovat zbylý volný protein (ověřeno filtrováním).
• Kontrola DNA pro klonování (NanoDrop): A260/A280 a A260/A230 pomáhají odhalit kontaminanty; přítomnost fenolu či EDTA ovlivňuje absorbanci a může inhibovat restrikční enzymy. NanoDrop umožnil rychlé QC před a po gelové extrakci, snížení selhání downstream kroků.
• A205 kvantifikace proteinů (NanoDrop): Metoda A205 (ε205≈31 nebo sekvenčně specifická podle Scopes/Anthis & Clore) nabízí vyšší citlivost než A280; ověřeno na polymyxinu a BSA s konzistentními výsledky s běžnými spektrofotometry.
• Nanoshelly a plasmon shift: NanoDrop One detekoval červený posun SPR u 150 nm nanoshellů po navázání thiol‑siRNA a mPEG‑SH, potvrzeno DLS a OliGreen — možnost mikroobjemové kontroly konjugace bez ředění.
• NanoDrop Eight + Acclaro: Softwarové algoritmy detekují přítomnost dsDNA v RNA a opačně, kvantifikují příměs a korigují výslednou koncentraci — zvyšuje spolehlivost výsledků pro qPCR a další citlivé postupy.
• Raman pro identifikaci finálního produktu a kvantifikaci konzervantů: DXR3 SmartRaman umožnil diskriminační identifikaci různých biologik přímo ve standardních lahvičkách a PLS modely pro stanovení dvou konzervantů s vysokým R² a nízkým RMSEP, potenciál jako rychlý in‑line QC test.
• Raman v downstream workflow: Modely pro arginin, histidin a sukrozu dokázaly v reálném čase sledovat UF/DF proces; Raman odhalil nežádoucí hydrolyzu sukrozy na glukózu a fruktózu během skladování bufferu (pH/osmolarita) díky nárůstu Q‑residua — využitelné pro kontrolní limity kvality.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlost a in‑line/an‑line měření s nízkými objemy vzorku (1–2 μL u NanoDrop, 2 μL pro nanoshelly, automatické sondy pro bioreaktor/UF/DF) zkracují rozhodovací cykly a náklady na laboratorní analýzy.
• Procesní Raman slouží jako PAT nástroj pro automatizaci (např. dávkování glukózy), řízení UF/DF a monitorování kvality bufferů a excipientů v reálném čase.
• FTIR a ATR nabízejí rychlé určení sekundární struktury proteinů, vhodné pro stabilitní studie, formulace a QC srovnatelné s konvenčními technikami.
• UV‑Vis (včetně integrující sféry) umožňuje detekci agregátů a přesné kvantifikace volného proteinu i v zakalených vzorcích.
• Standardizovaná chemometrická řešení (PLS, VIP, Q/T²) poskytují robustní nástroje pro kvantitativní i kvalitativní rozhodování.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Širší adopce multimodálních in‑line senzorů (Raman + NIR + UV‑Vis) integrovaných do řídicích systémů pro RTRT (real‑time release testing) a QbD strategie.
• Pokročilé metody přenosu kalibrace a standardizace modelů mezi přístroji, včetně strojového učení a doménové adaptace, aby se snížila potřeba rozsáhlých korekčních dat.
• Regulační akceptace PAT dat v kontextu uvolňování šarží — vyžaduje validaci modelů, rizikové analýzy a robustní kontrolní limity.
• Automatizace downstream procesů (přímé řízení UF/DF, dávkování excipientů) založená na reálných spektrech a prediktivních modelech.
• Zvýšené využití mikroobjemových UV‑Vis řešení pro kontrolu konjugace nanopartiklů a pro QC drahých biologických materiálů bez ředění.

Závěr

• Kompendium potvrdilo, že kombinace vibracních spektroskopií (FTIR, NIR, Raman) a UV‑Vis metod poskytuje efektivní, komplementární sadu nástrojů pro analýzu a řízení biopharma procesů. Tyto techniky umožňují rychlé rozhodování, snižují závislost na časově náročných offline metodách a otevírají cestu k automatizaci a real‑time release strategiím.
• Klíčová doporučení: důkladná chemometrická validace, plán pro přenos kalibrací mezi přístroji, pravidelné kontroly kvality bufferů a surovin, a integrace spektrálních nástrojů do procesního řízení pro dosažení opakovatelné výroby biologik.

Reference

1. Elliott A., Ambrose E.J. Structure of synthetic polypeptides. Nature. 1950;165:921–922.
2. Jackson M., Mantsch H.H. The use and misuse of FTIR spectroscopy in the determination of protein structure. Crit Rev Biochem Mol Biol. 1995;30:95–120.
3. Barth A. Infrared spectroscopy of proteins. Biochim Biophys Acta. 2007;1767:1073–1101.
4. Byler D.M., Susi H. Examination of the secondary structure of proteins by deconvolved FTIR spectra. Biopolymers. 1986;25:469–487.
5. Surewicz W.K., Mantsch H.H. New insight into protein secondary structure from resolution‑enhanced infrared spectra. Biochim Biophys Acta. 1988;952:115–130.
6. Villa J. et al. Use of Lykos and TruBio Software Programs for Automated Feedback Control to Monitor and Maintain Glucose Concentrations in Real Time. (Thermo Fisher application note.)
7. Zhang A. et al. Advanced Process Monitoring and Feedback Control to Enhance Cell Culture Process Production and Robustness. Biotechnol Bioeng. 2015;112(12):2495–2504.
8. Workman J. A review of calibration transfer practices and instrument differences in spectroscopy. Appl Spectrosc. 2018;73(3):340–365.
9. Guo S., Popp J., Bocklitz T. Chemometric analysis in Raman spectroscopy from experimental design to machine learning‑based modeling. Nat Protoc. 2021;16:5426–5459.
10. Anthis N.J., Clore G.M. Sequence‑specific determination of protein and peptide concentrations by absorbance at 205 nm. Protein Sci. 2013;22:851–858.
11. Hall D. et al. Characterization of protein aggregation and scattering effects by UV‑Vis. Anal Biochem. 2016;489:78–94.
12. Oldenburg S.J. et al. Nanoengineering of optical resonances. Chem Phys Lett. 1998;288:243–247.
13. Agrawal P. et al. A review of tangential flow filtration: process development and applications in the pharmaceutical industry. Org Process Res Dev. 2023;27(4):571–591.