Enhancing Monoclonal Antibody Yield and Quality Through Automated Multi-Component Feedback Control Loops Using the MarqMetrix All-In-One Process Raman Analyzer

Význam tématu

Udržení optimálního metabolismu buněk v bioreaktorech je klíčové pro maximalizaci výtěžku a kvality monoklonálních protilátek. Monitorování více analytů v reálném čase umožňuje řízené dávkování živin a vyrovnávání metabolických vedlejších produktů, zejména glukózy a laktátu. Použití procesní Ramanovy spektroskopie jako PAT (Process Analytical Technology) umožňuje nedeštruktivní, simultánní a vysokofrekvenční měření, které podporuje pokročilé zpětnovazební řídicí smyčky a automatizaci výroby.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo implementovat a ověřit tzv. total carbon control – udržení součtu glukózy a laktátu na definovaném setpointu 2 g/L – pomocí all-in-one procesního Raman analyzátoru. Studie porovnávala tři režimy řízení glukózy v 5 L bioreaktoru se CHO-K1 GS buňkami: 1) kontinuální automatické řízení glukózy (cílově 8 g/L), 2) standardní automatizovaný fed‑batch s bolusovým doplňováním (při <3 g/L doplnit na 6 g/L) a 3) nově navržené řízení celkového uhlíku (glukóza + laktát = 2 g/L). Hodnoceny byly titer, kvalita produktu (glykace/glykosylace), viabilita a dynamika laktátu.

Použitá metodika a instrumentace

Popis metodiky:

• Spektroskopická detekce: Raman v-line s frekvencí měření každé cca 2 minuty.
• Chemometrie: PLS regresní modely pro glukózu a laktát se selekcí spektrálních oblastí, předzpracováním a validací leave-one-out (LOOCV). Výběr počtu latentních proměnných optimalizován minimalizací RMSE kalibrace a křížové validace.
• Předzpracování spekter: Savitzky–Golay (1. derivace, order 2, okno 11–13), normalizace (SNV pro glukózu, L1-norma pro laktát), mean‑centering.
• Řízení procesu: Predikované koncentrace byly v reálném čase odesílány do řídicího systému (TruBio), který spolupracoval s DeltaV pumpou pro automatické dávkování glukózy podle definované logiky.

Použitá instrumentace:

• Thermo Scientific MarqMetrix All‑In‑One Process Raman Analyzer (785 nm laser).
• MarqMetrix Performance BallProbe™ Sampling Optic a volitelně FlowCell™ Sampling Optic.
• TruBio software pro sběr dat a integraci se systémem DeltaV pro automatické dávkování.
• Datové zpracování v interním Python prostředí a v komerčním softwaru (SOLO 9.3.1).

Parametry akvizice: laser 785 nm, výkon 450 mW, integrační doba 3000 ms, průměrování 20 snímků.

Hlavní výsledky a diskuse

Shrnutí klíčových nálezů:

• Řízení celkového uhlíku (glukóza + laktát) na 2 g/L vedlo k >10% zvýšení titru oproti konvenčním strategiím řízení glukózy.
• Kvalita produktu (glykace) se výrazně zlepšila: glykace klesla přibližně o 83 % vůči kontinuálnímu řízení a o 66 % vůči bolusovému fed‑batchu podle hlášených porovnání.
• Viabilita buněk byla při total carbon řízení po celou dobu vyšší; autoři uvádějí zlepšení viability (>15 % ve shrnutých přínosech).
• Strategie udržovaní konstantního součtu glukózy a laktátu podpořila metabolické posuny směrem k odbourávání laktátu v závěru běhu, čímž se omezila kumulace laktátu, která negativně ovlivňuje kvalitu a množství titeru.
• Chemometrické modely vykazovaly solidní predikční výkon: koeficient determinace R2 v rozmezí přibližně 0.8–0.96 a SEP pro laktát i glukózu v řádu desetin až jednotek g/L (v závislosti na modelu a rozsahu). To potvrzuje vhodnost Raman/P LS přístupu pro online kvantifikaci těchto analytů ve fermentačním médiu.

Diskuse:

• Multianalyzový přístup umožňuje dynamické přizpůsobení dávkování tak, aby se kompenzovalo změny v metabolismu buněk (např. přesun mezi produkcí a spotřebou laktátu).
• Ramanova spektroskopie v tomto kontextu nahrazuje nebo doplňuje tradiční off‑line analýzy, protože poskytuje časté a bezkontaktní údaje pro řízení procesu bez zásahu do kultury.
• Modelová přenositelnost a robustnost vůči různým kulturám, médiím a hustotám buněk byla zmíněna jako dosažitelná prostřednictvím vhodné chemometrické strategie a interního zpracování dat.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a kontinuální detekce více kritických parametrů (glukóza, laktát, event. VCD) v reálném čase, která podporuje přesné dávkování živin a snižuje variabilitu mezi šaržemi.
• Snížení nežádoucích modifikací produktu (glykace) vede k lepší konzistenci kvality a potenciálně nižším nákladům na čištění a kontrolu kvality.
• Platforma se snadno integruje do průmyslových řídicích systémů (DeltaV, TruBio), což usnadňuje zavedení do automatizovaných výrobních linek a přípravu zásad pro inteligentní výrobu.
• Malá fyzická stopa, modularita sond a možnost sledovat více analytů jedním měřením zvyšují provozní efektivitu a flexibilitu nasazení v různých bioprocesních konfiguracích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření kontrolních smyček o další metabolity (aminokyseliny, produkty post‑translačních modifikací) pro ještě sofistikovanější řízení metabolismu.
• Využití pokročilých algoritmů strojového učení pro prediktivní kontrolu a adaptivní modelování výkonu v průběhu šarže.
• Integrace s kontinuálními výrobními platformami a digital twin koncepty pro optimalizaci toku materiálu a včasnou detekci odchylek procesu.
• Zlepšení přenositelnosti chemometrických modelů mezi pracovišti a škálami pomocí standardizace datových protokolů a kalibračních strategií.

Závěr

Uplatnění procesní Ramanovy spektroskopie v kombinaci s chemometrickými PLS modely a automatizovaným řízením umožnilo efektivní udržení celkového zdroje uhlíku v bioreaktoru, což vedlo k vyššímu titru, lepší kvalitě produktu a zlepšené viabilitě buněk. Technologie MarqMetrix All‑In‑One ukazuje schopnost poskytovat vysoce frekventní, víceanalyzová data, která lze přímo použít k řízení dávkování v reálném čase, a představuje tak perspektivní PAT řešení pro inteligentní a škálovatelnou bioprodukci.

Reference

1. Abu‑Absi NR, Kenty BM, Cuellar ME, Borys MC, Sakhamuri S, Strachan DJ, Hausladen MC, Li ZJ. Real Time Monitoring of Multiple Parameters in Mammalian Cell Culture Bioreactors Using an In-Line Raman Spectroscopy Probe. Biotechnol. Bioeng. 2011, 108(5):1215–1221.
2. Zhou M, Crawford Y, Ng D, Tung J, Pynn AFJ, Meier A, Yuk IH, Vijayasankaran N, Leach K, Joly J, Snedecor B, Shen A. Decreasing Lactate Level and Increasing Antibody Production in Chinese Hamster Ovary Cells (CHO) by Reducing the Expression of Lactate Dehydrogenase and Pyruvate Dehydrogenase Kinases. J. Biotechnol. 2011, 153(1):27–34.
3. Villa J, Khadka N, Keck K, Zhang L, Zustiak M. Process Raman as Platform Solution For Automated Glucose Feeding in Fed-Batch Bioreactors. (Application note / internal report)
4. Villa J, Zustiak M, Ramirez D, Kruger J, Kuntz D, Zhang L, Khadka N, Broadbelt K, Woods S. Demonstrating Chemometric Model Transferability for 5 Mammalian Cell Lines and 5 Media Types Using the Thermo Scientific MarqMetrix All-In-One Process Raman Analyzer to Monitor Upstream Bioprocesses. (Application note / internal report)
5. Villa J, Zustiak M, Kuntz D, Zhang L, Khadka N, Broadbelt K, Woods S. Use of Lykos and TruBio Software Programs for Automated Feedback Control to Monitor and Maintain Glucose Concentrations in Real Time. (Application note / internal report)