Kapilární elektroforéza - Separační analytická metoda pro věk mikročipů

Brzy po objevu zdroje elektrického proudu – galvanických článků – se lidé začali zajímat o to, co se při průchodu elektrického proudu děje v různých látkách. V roztocích a taveninách některých látek probíhají chemické reakce na rozhraní s materiálem, jímž se proud do roztoku přivádí. Tyto reakce byly nazvány elektrolýza a část chemie, která se jimi zabývá, elektrochemie. Kromě reakcí na elektrodách se při průchodu proudu v roztocích přemísťují nabité částice mezi elektrodami, například ionty nebo koloidní částice. Ukázalo se, že v roztocích má každý druh částic pohybujících se v elektrickém poli svou charakteristickou rychlost, což se dá využít pro analýzu či separaci směsí. Metoda, která se k tomu využívá, se nazývá elektroforéza.

Historie objevů elektroforézy

Roku 1892 byl popsán pohyb anorganických částic v elektrickém poli v koloidním roztoku a brzy poté se ukázalo, že podobně putují i proteiny ve vodných roztocích. V třicátých letech dvacátého století zkonstruoval švédský elektrochemik Arne Tiselius zařízení umožňující rozdělit proteiny krevního séra na základě jejich rozdílných rychlostí pohybu v elektrickém poli (r. 1948 za to dostal Nobelovu cenu). V nepříliš odlišném uspořádání se elektroforéza proteinů krevního séra jako diagnostická metoda dodnes používá na mnoha klinikách.

V polovině šedesátých let vznikla elektroforetická metoda kapilární izotachoforéza, určená převážně pro analýzu směsi malých iontů, anorganických i organických.

Roku 1981 elektroforézu čekala renezance. J. W. Jorgenson a K. D. Lukacsová popsali separaci různých iontů (aminokyselin, dipeptidů, aminů) zónovou elektroforézou ve velmi tenké skleněné kapiláře s vnitřním průměrem 75 m. Účinnost separace v porovnání s velmi rozšířenou kapalinovou chromatografií byla do té doby nevídaná. Zmíněný článek byl od té doby citován asi 1200krát.

Kapilární zónová elektroforéza (obrázek níže - nahoře). Transport analyzovaných iontů (analytů) a jejich separace probíhá v kapiláře, která propojuje dvě nádobky. Kapilára je většinou z taveného křemene, mívá vnitřní průměr řádově desítky či stovky mikrometrů a délku mezi 10 centimetry až 1 m. Do roztoku základního elektrolytu jsou vnořeny elektrody, jimiž se přivádí elektrické napětí obstarávající pohyb iontů. Základní elektrolyt se plní do kapiláry přetlakem nad hladinou kapaliny v jedné nádobce. Potom se jeden konec kapiláry ponoří do nádobky s analyzovaným vzorkem a malý sloupeček vzorku vnikne na její začátek. Kapilára se vrátí do nádobky se základním elektrolytem a zapne se hnací napětí. V elektrickém poli se některé analyzované látky pohybují rychleji, jiné pomaleji, což způsobuje jejich separaci. Na druhém konci kapiláry je detektor zaznamenávající průchod jednotlivých rozdělených látek. Jako detekční metodu lze využít třeba absorpci tenkého svazku monochromatického světla, který prochází napříč kapilárou. Signál z detektoru v okamžicích průchodu analyzovaných iontů změní svou hodnotu a na časovém záznamu se ukáže špička – pík neboli zóna (čím je vyšší a užší, tím větší je účinnost separace).

Kapilární izotachoforéza (obrázek níže - dole). Od zónové elektroforézy se liší tím, že používá dva elektrolyty: vedoucí a koncový. Vedoucím elektrolytem je naplněna jedna nádobka a kapilára, koncový elektrolyt je v druhé nádobce. Analyzovaný vzorek se dávkuje na počátek kapiláry (tj. na rozhraní mezi vedoucím a koncovým elektrolytem). Ion vedoucího elektrolytu se volí co nejrychlejší (rychlejší než kterýkoli ion dělené směsi), ion koncového elektrolytu co nejpomalejší. Při pohybu v elektrickém poli se pak analyzované ionty sice separují, ale nevzdalují se od sebe a zůstávají jeden za druhým ve sloupečcích. Po separaci se všechny sloupce pohybují stejnou rychlostí. Díky samozaostřujícímu efektu izotachoforézy odolávají rozhraní mezi sloupci difuzi a zůstávají ostrá. Časový záznam signálu při průchodu zón přes detektor pak místo píků poskytuje pravoúhlé schody, jejichž délka je přesně přímo úměrná množství analytu – kvantitě.

Vesmír

Kapilární elektroforéza dnes

Nyní se tímto termínem označuje separační metoda využívající pohyb nabitých částic, ať už malých iontů či makromolekul (proteinů, fragmentů DNA) v elektrickém poli, a to buď přímo ve volném roztoku elektrolytu, nebo v nějakém nosném médiu, například gelu. Je-li elektrolytem nebo médiem naplněna kapilára, říká se metodě kapilární elektroforéza. Podle způsobu separace se dělí na kapilární zónovou elektroforézu, kapilární izotachoforézu a další.

Doprovodný jev – elektroosmotický tok

Elektroosmóza. Na vnitřním povrchu kapiláry se stýká kapalný roztok s pevnou stěnou kapiláry. Na velmi tenkém místě styku vzniká elektrická dvojvrstva. Její pevná část je tvořena vnitřní stěnou kapiláry a většinou bývá nabita plošným elektrickým nábojem, který je „přilepen“ na stěně, a proto je nepohyblivý. Kompenzován je vrstvičkou (asi 10 nm silnou) opačného náboje v kapalné části dvojvrstvy, která se v elektrickém poli může pohybovat. Napětí vyvolávající elektroforetický pohyb analyzovaných iontů má vzhledem ke kapiláře podélný směr a nemůže způsobit pohyb nabité pevné části dvojvrstvy (kapiláry). Naproti tomu vrstvička opačného náboje v kapalině blízko stěny podlehne působení hnacího pole a dá se do pohybu směrem k příslušnému pólu, čímž strhne celý průřez kapaliny v kapiláře. Tomuto jevu se říká elektroosmóza. Na rozdíl od elektroforézy, při které putují pouze nabité ionty a zbytek roztoku (voda) je v klidu, teče při elektroosmóze celý roztok najednou, pohybuje se jako píst. Rychlost elektroosmotického toku je všude stejná – jak u stěny, tak uprostřed kapiláry.

Elektroosmózu lze ovlivnit složením roztoku, zejména přídavky nepatrných koncentrací povrchově aktivních látek (tenzidů), které pokryjí vnitřní povrch kapiláry a změní rychlost, popřípadě i směr toku. Elektroosmotický tok sám o sobě analyzované ionty nedělí, pouze čerpá roztok elektrolytu z jedné nádobky do druhé.

Unikátní vlastnosti elektroosmotického toku – jeho pístového rychlostního profilu – se však využívá v separačních metodách, jakými jsou kapilární elektrochromatografie a micelární elektrokinetická chromatografie, které kombinují kapalinovou chromatografii a elektroforézu.

Co všechno lze analyzovat

Možnosti aplikací kapilární elektroforézy jsou v současné době velmi rozsáhlé a zasahují často do analytických úkolů, které se dříve řešily vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií a iontovou chromatografií. Jedna z aplikací za všechny – stanovení zajímavých látek ve víně – je ukázána v článku J. Pazourka a J. Havla, Vesmír 80, 372, 2001/7.

Elektroforéza si při separaci může vzít na pomoc i další mechanizmy. Gelová elektroforéza využívá gel nejen jako nosné médium, ale také jako síto, přes které malé molekuly procházejí lépe a rychleji než veliké. Díku tomu lze dělit nabité molekuly podle velikosti. Využívá se to například při separaci různě dlouhých sekvenačních fragmentů DNA. Ještě před separací jsou fragmenty pomocí sekvenační reakce označeny čtyřmi fluorescenčními značkami – barvivy odpovídajícími čtyřem nukleotidovým bázím tvořícím řetězec DNA, a to cytozinu, guaninu, adeninu a tyminu. Na kapiláru se příčně svítí laserovým svazkem a světlo emitované barvivy při průchodu fragmentů se snímá čtyřmi detektory, z nichž každý své barvivo rozpozná přes příslušný optický filtr (viz. obrázek níže). Signál se zpracuje počítačovým programem, který udá sekvenci nukleotidů v analyzovaném fragmentu.

Vesmír

V posledních letech kapilární elektroforéza podstatně urychlila postup prací při sekvencování lidské DNA, jejíž délka je kolem tří miliard nukleotidů. Pro tento účel byly vyrobeny přístroje, které byly osazeny desítkami až stovkami paralelních kapilár, v nichž separace probíhala současně.

Laboratoř na mikročipu

Několik světových firem pracuje na vývoji chemických mikročipů. Různými technikami, vypracovanými většinou již při vývoji elektronických čipů, lze vytvořit v plastických hmotách, křemeni či skle soustavu kanálků, které budou při elektroforetické separaci nahrazovat dosavadní křemenné kapiláry. Na těchto čipech mohou být dále nádobky na další činidla, která se budou přečerpávat a reagovat se vzorky. Vzniklé produkty se mohou analyzovat. Celý proces bude samozřejmě řízen počítačem s příslušným softwarem.

Takovým způsobem lze v budoucnu získávat informace ze světa molekul. Elektroforéza při tom bude hrát důležitou roli. Koncepce laboratoře na čipu se již dostávají na trh.

Kapilární elektrochromatografie používá kapiláry naplněné stacionární fází jako kapalinová chromatografie, avšak pro pohon mobilní fáze v koloně využívá elektroosmózu jako pumpu. Díky pístovému profilu elektroosmotického toku dosahuje ve velké většině případů lepší účinnosti separace než klasická kapalinová chromatografie.

Micelární elektrokinetická chromatografie rovněž kombinuje prvky chromatografie a elektroforézy. Do základního elektrolytu se přidá látka, která je schopna vytvářet micely – kulovité vícemolekulární útvary s určitou strukturou. Mezi takové látky patří třeba mýdla nebo tenzidy. Micely jsou nabité a putují v kapiláře v elektrickém poli jako kterékoliv nabité částice. Jestliže se do kapiláry nadávkuje neutrální vzorek, nemůže sám putovat v elektrickém poli, ale může interagovat s micelami, které putují kolem něj, přičemž jednotlivé složky vzorku mohou interagovat různě. Tím, že jsou unášeny micelami, získají vlastní pohyb, který umožní jejich separaci.