Preklinické testování potenciálních léčiv

Přednášející

• MUDr. Jan Kopecký, DrSc. (Fyziologický ústav AV ČR, v. v. i.)
• doc. Ing. Tomáš Čajka, Ph.D. (Fyziologický ústav AV ČR, v. v. i.)
• Ing. Lukáš Werner, PhD. (Biotechnologický ústav AV ČR, v.v.i.)
• MVDr. Štefan Juhás, Ph.D. (Ústav živočišné fyziologie a genetiky AV ČR, v. v. i.)

Fyziologický ústav je hlavním koordinátorem výzkumného programu "Preklinické testování potenciálních léčiv", který je zařazen do Strategie Akademie věd ČR AV21: „Špičkový výzkum ve veřejném zájmu“.

Preklinické testování kandidátních látek na zvířatech je nezbytnou součástí vývoje nových léčiv. Bez těchto testů nelze přistoupit ke klinickým testům na lidských dobrovolnících. Finální preklinické testy provedené v režimu správné laboratorní praxe (SLP), dle vyhlášky 86/2008 Sb, jsou nezbytným předpokladem pro schválení klinického hodnocení ze strany Státního ústavu pro kontrolu léčiv (SÚKL). Výsledky preklinických studií poskytují cennou zpětnou vazbu pro posouzení perspektiv aplikovaného výzkumu.

Program preklinického testování potenciálních léčiv (dále jen program) využívá kapacitu přístrojového vybavení pro základní výzkum. Program preklinického testování léčiv na pracovištích AV ČR zapadá do Strategie AV21, protože usnadňuje transfer výsledků základního výzkumu slibných terapeutických látek do komerční sféry a do klinické praxe. Vytváří se tak zcela unikátní možnost pro zapojení akademických pracovišť do prakticky aplikovaného výzkumu s velkým společenským významem. Program je výsledkem dlouhodobé koncepční snahy spolupracujících partnerů o vytvoření zázemí pro komplexní testování potenciálních léčiv vznikajících zejména na půdě AV ČR a bez podpory z prostředků Strategie AV 21 by nebyl uskutečnitelný. Vzhledem k dlouhodobému charakteru vývoje léčiv bude význam výsledků programu postupně narůstat.

Centrum pro preklinické testování (CPT) tvoří následující pracoviště: Fyziologický ústav AV ČR (FGÚ), Ústav molekulární genetiky AV ČR (ÚMG), České centrum pro fenogenomiku (CCP), Biotechnologický ústav AV ČR (BTÚ) a Ústav živočišné fyziologie a genetiky AV ČR (ÚŽFG) - Centrum Pigmod.

Fyziologický ústav celý program koordinuje a zajišťuje funkci testovacího zařízení (provádění testů toxicity na malých laboratorních zvířatech), včetně testů v režimu SLP certifikovaného od SÚKL. Ostatní zapojené ústavy fungují jako testovací místa, která mají již v oblasti své odbornosti zaveden systém SLP.

Prekliniky témata

• Syntézy chemických látek s potenciálem využití pro humánní terapii, zajištění certifikace syntetizovaných látek a vývoj příslušných aplikačních forem Řešitel: Lukáš Werner (BTÚ)

• Studie toxicity včetně toxikokinetických studií slibných chemických látek na modelových zvířatech (myš, potkan, morče, králík, miniprase) Řešitel: Světlana Žufanová (FGÚ), Štefan Juhás (ÚŽFG)

• Bioanalytické, hematologické a biochemické testování vzorků odebraných testovaným zvířatům při toxikologických studiích Řešitel: Světlana Žufanová (FGÚ), Karel Chalupský (ÚMG)

• Vývoj a validace bioanalytických metod pro různé testovací systémy Řešitel: Karel Chalupský (ÚMG), Tomáš Čajka (FGÚ)

• Histopatologické testování/vyšetření tkání zvířat ze studií Řešitel: Šárka Suchanová (ÚMG)

Oddělení metabolomiky Fyziologického ústavu Akademie věd České republiky

Oddělení metabolomiky Fyziologického ústavu Akademie věd České republiky (FGÚ AV ČR) poskytuje servisní měření polárních metabolitů, komplexních lipidů a sloučenin exposomu (včetně léčiv) v biologických materiálech (plazma, sérum, tkáně a buňky) metodami kapalinové chromatografie ve spojení s hmotnostní spektrometrií (LC–MS). Molekulové hmotnosti těchto látek se obvykle pohybují v rozmezí 50 až 2000 Da a jejich koncentrace se mohou pohybovat v několika řádech.

Pro analýzu hodnocených léčivých přípravků (IMP) a léčiv je laboratoř certifikována pro práci podle pravidel Správné laboratorní praxe (OECD GLP) a pravidelně monitorována národní autoritou (Státní ústav pro kontrolu léčiv).

Předmětem bádání Oddělení metabolomiky:

• Necílená metabolomika, lipidomika a exposomika

• Cílená fluxomika

• Cílená analýza lipidových mediátorů

• Cílená analýza léčiv a hodnocených léčiv (imp)

• Analýza vzorků

Vedoucí laboratoře je doc. Ing. Tomáš Čajka, Ph.D.

NECÍLENÁ METABOLOMIKA, LIPIDOMIKA A EXPOSOMIKA

LC–MS postup LIMeX (LIpidy, Metabolity, a sloučeniny eXposomu) je používán pro necílenou analýzu komplexních lipidů, polárních metabolitů a sloučenin exposomu (např. léčiv).

Dvoufázová extrakční metoda s použitím methanolu, methyl terc-butyl etheru (MTBE) a vody zahrnuje dvě fáze: jednu pokrývající polární metabolity („metabolomika“) a různé sloučeniny exposomu, jako jsou léčiva („exposomika“) a druhou zahrnující komplexní lipidy („lipidomika“). Pro necílené analýzy jsou používány validované LC–MS metody.

Jelikož pouze jedna jediná LC–MS analýza nedokáže pokrýt celý metabolom/lipidom/exposom, jsou používány odlišné chromatografické metody (kapalinová chromatografie s obrácenými fázemi – RPLC a hydrofilní interakční chromatografie – HILIC) a režimy ionizace elektrosprejem pro komplexní charakterizaci daných izolovaných frakcí.

Pro pracovní postup LIMeX je používán hmotnostní spektrometr s vysokým rozlišením Thermo Q Exactive Plus ve spojení s kapalinovým chromatografem (Thermo Vanquish). Hmotnostní spektrometr sbírá pro všechny vzorky MS1 spektra a dále data-dependentní MS/MS spektra. Zatímco pro kvantifikaci se používají výšky chromatografických křivek z MS1, MS/MS spektra slouží pro anotaci sloučenin pomocí spektrálních MS/MS knihoven, nebo pro konfirmaci analytu. Získané přístrojové soubory jsou zpracovány pomocí softwaru MS-DIAL 4, včetně anotace komplexních lipidů, polárních metabolitů a dalších detekovaných sloučenin s využitím vlastních, otevřených i komerčních MS/MS spektrálních knihoven (NIST20, MassBank, MoNA).

Pracovní postup LIMeX pro necílenou a cílenou analýzu komplexních lipidů, polárních metabolitů a sloučenin exposomu.

Pro humánní kohortové studie je obvykle reportováno přes 500 komplexních lipidů, 100 polárních metabolitů a desítky sloučenin exposomu (převážně složky potravin a léčiva) pomocí LIMeX-4D (tj. 4 LC–MS platformy).

Všechny sloučeniny jsou kvantifikovány jako výšky chromatografických píků a uváděny v intenzitách detektoru. Tyto hodnoty slouží jako vstup pro jednorozměrné nebo vícerozměrné statistické metody (např. t-test, míra velikosti účinku – fold change, teplotní mapy – heatmaps, analýza hlavních komponent – PCA, částečná diskriminační analýza nejmenších čtverců – PLS-DA).

Pracovní postup LIMeX používá více než 60 různých vnitřních standardů, které lze použít k odhadu absolutních koncentrací různých metabolitů detekovaných v plazmě/séru a tkáních.