Measuring the purity of low volumes of DNA at 4 °C using the Agilent Cary 60 UV-Vis spectrophotometer with fiber optics microprobe

Význam tématu

Spektrofotometrické měření čistoty a koncentrace DNA je zásadní v biotechnologii a molekulární biologii. Umožňuje rychlou, přesnou a neinvazivní analýzu malých objemů vzorků, šetří čas, vzorek i náklady a poskytuje spolehlivé výsledky pro výzkum i průmyslovou praxi.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo ověřit možnost přímého měření čistoty mikroobjemů DNA při 4 °C bez použití kyvet pomocí Agilent Cary 60 UV-Vis se sondou na optická vlákna. Studie demonstruje zkrácení času analýzy a snížení nákladů při zachování vysoké přesnosti a reprodukovatelnosti.

Použitá metodika

Calf thymus DNA bylo připraveno v koncentracích 0–50 µg/mL v deionizované vodě. Vzorky o objemu 150 µL byly uchovávány v Eppendorfových tubách při 4 °C a měřeny za běžného laboratorního osvětlení. Pro určení absorpčních vrcholů probíhalo skenování v rozsahu 340–240 nm, pro výpočet čistoty se používal poměr absorbancí při 260 a 280 nm s korekcí pozadí při 320 nm.

Použitá instrumentace

• Spektrofotometr Agilent Cary 60 UV-Vis s xenonovou výbojkou
• Fiber optic microprobe a fiber optic probe coupler
• Software WinUV modul RNA-DNA Estimation
• Quartzové kyvety o délce dráhy 1 cm (balení 2 ks)

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza potvrdila charakteristický absorpční vrchol DNA při 260 nm. Kalibrační přímka pro koncentrace 0–50 µg/mL má rovnici Abs = 0,02004 × koncentrace a korelační koeficient R² = 0,9976. Všech pět vzorků bylo změřeno za méně než dvě minuty, což představuje více než 80% úsporu času oproti konvenčnímu postupu. Eliminuje se manipulace s kyvetami a riziko kontaminace, přičemž se zachovává vysoká reprodukovatelnost dat.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zkrácení doby analýzy a zvýšení laboratorní efektivity
• Úspora nákladů na spotřební materiál díky vyloučení použití kyvet
• Možnost přímého měření vzorků při teplotách od 4 do 110 °C bez vzniku kondenzace
• Analýza velmi malých objemů (od 40 µL) i větších objemů bez omezení
• Možnost rozšíření na stanovení proteinů, RNA, pevných nebo gelových vzorků pomocí reflektančních sond

Budoucí trendy a možnosti využití

Metodu lze adaptovat na další biomolekuly, včetně proteinů a RNA. Vývoj přenosných spektrofotometrů s optickými vlákny a integrace do automatizovaných systémů otevírá možnosti polního měření a online kontroly kvality ve farmaceutickém i biotechnologickém průmyslu.

Závěr

Agilent Cary 60 UV-Vis se sondou na optická vlákna představuje efektivní platformu pro rychlé, přesné a reprodukovatelné měření čistoty malých objemů DNA při nízkých teplotách bez nutnosti kyvet. Spojení vysoké citlivosti xenonové lampy a automatizovaného softwaru přináší významné úspory času a nákladů.

Reference

1. Warburg O. a Christian W. Biochemische Zeitschrift 1942;310:384.
2. Sambrook J., Fritsch E.F. a Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. vydání. Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989.
3. Keighley B. a Fyfe D. Application Note #91. Agilent Technologies; 1995.