Simple and rapid quantitation of microliter DNA samples using the Agilent Cary 50/60 UV-Vis

Význam tématu

UV-Vis spektroskopie je klíčová pro rychlou a neinvazivní kvantifikaci biomolekul, zejména nukleových kyselin. Trend miniaturizace přístrojů a používání mikrolitrových objemů podporuje vysokou propustnost vzorků, snižuje náklady a zachovává kvalitu dat.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo ověřit schopnost spektrofotometrů Agilent Cary 50/60 vybavených ultra-mikroobjemovou kyvetou pro přesné a opakovatelné stanovení koncentrace DNA v objemech již od 4 µl. Studie porovnává měření v mikrolitrovém režimu s konvenčním 1 cm kyvetovým systémem.

Použitá metodika a instrumentace

Pro analýzu byly připraveny neředěné vzorky plasmidové DNA o objemu 4 µl a vzorky naředěné 100× pro měření v 1 cm kyvetě (cca 400 µl). Pořizovaly se absorbance při 260 nm, 280 nm a korekčním 320 nm.

• Spektrofotometr: Agilent Cary 50 nebo Cary 60 UV-Vis
• Zdroj: xenonová výbojka s vysokou intenzitou
• Kyveta: ultra-mikroobjemová s dráhou 1,0 mm (možno od 0,2 mm)
• Spektrální štěrbina: <1,5 nm šířka pásma
• Software: DNA/RNA modul v Cary WinUV pro měření absorbance a výpočet poměru A260/A280

Hlavní výsledky a diskuse

Opakovatelné skeny 4 µl vzorků ukázaly poměr A260/A280 s průměrem 1,747 a relativní standardní odchylkou 0,29 %, což odpovídá koncentraci ~1225 µg/ml. Pro srovnání 400 µl vzorků v 1 cm kyvetě byly zjištěny hodnoty poměru 1,63 a RSD 0,17 %, koncentrace ~118 µg/ml. Výsledky potvrzují vysokou reprodukovatelnost měření i u minimálních objemů.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí rychlé (<2 s) a přesné stanovení koncentrace DNA bez nutnosti zničení vzorku či rozsáhlého čištění kyvet. Ultra-mikroobjemová kyveta umožňuje měření neředěných vzorků, rozšíření fotometrického rozsahu nad 150 Abs a výrazné úspory spotřebního materiálu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření této technologie na stanovení proteinů a dalších biologických makromolekul, další miniaturizace a integrace do plně automatizovaných pracovních linek pro vysokopropustnou analýzu vzorků.

Závěr

Agilent Cary 50/60 UV-Vis ve spojení s ultra-mikroobjemovou kyvetou představuje spolehlivý nástroj pro kvantifikaci DNA v mikrolitrových objemech. Metoda kombinuje vysokou přesnost, rychlost a omezuje náklady na spotřební materiál.

Reference

Warburg O, Christian W (1942) Biochem Z 310:384.