Precision Microvolume Spectrophotometry of Lysosyme at 100mg/ml

Význam tématu

Vysoké koncentrace proteinů představují výzvu pro klasické spektrofotometry kvůli omezenému dynamickému rozsahu a vysoké hladině šumu při malých objemech vzorku. Nové mikroobjemové kyvety umožňují měření absorbance již v 1 µl, čímž otevírají možnosti detailní analýzy proteinů i při extrémně vysokých či nízkých koncentracích.

Cíle a přehled studie

• Ověřit přesnost a opakovatelnost měření lysozymu o koncentraci 100 mg/ml v mikroobjemové kyvetě.
• Porovnat výsledky s predikcí z měření v běžné 1 cm kyvetě.
• Identifikovat neočekávané jevy v absorbanci vysoce koncentrovaného roztoku.

Použitá metodika a instrumentace

• Spektrofotometr: Agilent (dříve Varian) Cary 6000i (v UV/Vis režimu 200–380 nm).
• Mikroobjemová kyveta: Hellma Traycell s 0,2 mm (1 µl) a modifikovanou 1 cm dírkou pro maximální přesnost.
• Nastavení: šířka pásma 2 nm, rychlost skenování 60 nm/min, doba průměrování 2 s, datový interval 2 nm, zadní tlumení paprsku nastavena na 1,3 Abs.
• Vzorek: lysozym 100 mg/ml v deionizované vodě (Sigma Aldrich).

Hlavní výsledky a diskuse

• Místo očekávaného vrcholu u 280 nm (až 200 Abs extrapolací) se objevila plošinová oblast kolem 2 Abs (ekvivalentně ~40 Abs v 1 cm kyvetě).
• Reprodukovatelnost měření prokázala stabilitu signálu i po 12 minutách (odchylka <±0,0006 Abs).
• Výsledky naznačují neobvyklé chování vysoce koncentrovaných roztoků – možné molekulární asociace nebo změny v elektronové struktuře proteinů.

Přínosy a praktické využití metody

• Měření proteinů v rozsahu 20 µg/ml až 100 000 µg/ml v mikrolitrových objemech.
• Možnost ověřit čistotu a koncentraci vzorku skenováním spektra při vysoké hustotě.
• Úspora vzorku a časy analýzy pro biochemické i klinické aplikace.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další studie s různými délkami optické dráhy a přesnými ředěními pro odhalení molekulárních interakcí.
• Aplikace v analýze nukleových kyselin (detekce DNA/RNA na úrovni ng).
• Integrace s automatizovanými vyhodnocovacími systémy pro vysokoprůchodovou analytiku.

Závěr

Nový přístup kombinuje výkonný referenční spektrofotometr s mikroobjemovou kyvetou, čímž umožňuje přesná měření absorpce proteinů v extrémních koncentracích. Neočekávané výsledky poukazují na fyzikální jevy v koncentrovaných roztocích, které vyžadují další hlubší výzkum.

Reference

Varian, Inc. (2005) Sample Analysis Report No. 50: Precision Microvolume Spectrophotometry of Lysozyme at 100 mg/ml.