Accuracy in Microvolume Measurements. Investigating the Precision and Reproducibility of Cary 50, 300 and 4000 series Instruments for Microlitre samples

Význam tématu

Analýza mikroobjemů je klíčová pro práci s omezeným množstvím vzorku, zejména při kvantifikaci nukleových kyselin a proteinů. Přesná a reprodukovatelná měření v rozsahu mikrolitrů umožňují výzkum genetického materiálu a kinetických studií enzymů bez nadbytečného zředění vzorku.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo porovnat přesnost, citlivost a opakovatelnost tří UV/Vis spektrofotometrů Agilent Cary – modelů 50, 300 a 4000 – při analýze mikroobjemů s použitím příslušenství Hellma TrayCell.

Použitá instrumentace

• Agilent Cary 50 se xenonovou výbojkou a Czerny-Turner monochromátorem
• Agilent Cary 300 výzkumná třída
• Agilent Cary 4000 s Littrow dvojitým mimoosým monochromátorem
• Hellma TrayCell pro mikroobjemy (1–4 µl)

Použitá metodika

Přístroje byly kalibrovány pomocí integrovaného align modulů. TrayCell byl nasazován a odebírán bez významné změny v hodnotách referenčního signálu. Vzorky ssDNA a modelová „falešná DNA“ byly sledovány při různých koncentracích (0,5–50 µg/µl) a objemech 1–4 µl.

Hlavní výsledky a diskuse

• Cary 50 kvantifikoval ssDNA od ~1 µg/µl s chybou ~3 % při 5 µg/µl, při 2–5 ng/µl poskytl stále validní data, ale se zvýšeným šumem.
• Cary 300 dosáhl lineárního rozsahu až 4 Abs ve 1 mm kyvety (ekvivalent 40 Abs při 1 cm), reprodukovatelnost <1 %.
• Cary 4000 nabídnul rozsah až >9 Abs a šum na úrovni 0,0001 Abs, detekce ssDNA až 0,5 µg/µl (500 pg/µl) s ~10 % kvantifikační chybou.
• TrayCell brání odpařování, umožňuje kinetické experimenty a opakované snímání mikroobjemů po dobu desítek minut.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje úsporu vzorku, rychlou analýzu DNA/RNA, kontrolu kvality a sledování enzymatických reakcí v mikroobjemech. Cary 50 je vhodný pro rutinní kvantifikaci, Cary 4000 pro nejnižší koncentrace a vysoký dynamický rozsah.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace mikroobjemových spektrofotometrů do vysokoprůtokových laboratoří
• Další zlepšení calibračních algoritmů pro extrémně nízké koncentrace nukleových kyselin
• Rozšíření aplikací pro mikrofluidické a kinetické studie enzymů

Závěr

Porovnání ukázalo, že každý Cary model má své silné stránky: Cary 50 pro rychlé a spolehlivé rutinní měření, Cary 300 pro širší dynamický rozsah, Cary 4000 pro nejvyšší citlivost a nízký šum. Volba závisí na požadavcích na koncentraci vzorku a požadovanou přesnost.