Conformational Studies Using Second Derivative UV-Vis Absorption Spectroscopy

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAb) se stávají klíčovými léčivy v humánní medicíně. Po vypršení patentové ochrany inovátoru se na trh dostávají biosimilars, tedy kopie originálních mAb, jejichž strukturní srovnání je nezbytné pro zajištění bezpečnosti a účinnosti.

Cíle a přehled studie / článku

Studie se zaměřila na porovnání konformační stability rituximabu (inovátor) a jeho biosimiláru pomocí druhé derivace UV-Vis absorpční spektroskopie. Cílem bylo prokázat, zda jsou změny ve struktuře aromatických zbytků u obou protilátek srovnatelné po denaturaci chemickým činidlem.

Použitá metodika a instrumentace

V analýzách byl použit přístroj Agilent Cary 60 UV-Vis spektrofotometr vybavený Xenonovou výbojkou. Spektra (240–350 nm, krok 0,5 nm) byla sbírána v 1 cm kyvetě při pokojové teplotě. Druhá derivace byla vypočtena v softwaru Cary WinUV pomocí Savitzky–Golayova filtru (5 bodů) a následně rozšířena spline funkcí (rozlišení 0,01 nm).

Vzorky mAb (500 mg/mL v Tris-HCl pH 6,0) byly denaturovány GdnHCl v koncentracích 0–6 M. Pro referenci byly použity roztoky L-fenylalaninu, L-tyrosinu a L-tryptophanu.

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza druhé derivace absorpce ukázala:

• Pro volné aromatické aminokyseliny charakteristické spektrální píky, které se u mAb promítají do podobných vzorců druhé derivace.
• Při zvýšení koncentrace GdnHCl došlo k posunu negativního vrcholu tryptofanu (~291 nm), indikujícímu změnu mikroprostředí zbytků W.
• Denaturační křivky inovátoru a biosimiláru vykazují téměř shodné posuny v závislosti na koncentraci GdnHCl, což signalizuje obdobnou konformační stabilitu.
• Poměr a/b (analýza tyrosinových a tryptofanových příspěvků) se zvyšuje se stoupající denaturací, opět beze statisticky významných rozdílů mezi oběma mAb.

Přínosy a praktické využití metody

UV-Vis spektroskopie s druhou derivací je:

• Rychlá, cenově nenáročná a nedestruktivní technika pro předběžné hodnocení vyšší řádové struktury proteinů.
• Ideální ortogonální nástroj pro QC laboratoře, doplňující technologie jako HPLC či hmotnostní spektrometrie.
• Umožňuje sledovat jemné změny v mikroprostředí aromatických zbytků bez potřeby složitých činidel či přípravných kroků.

Budoucí trendy a možnosti využití

Do budoucna lze očekávat:

• Integraci s mikrotitračními měřicími systémy pro vyšší propustnost vzorků.
• Kombinaci UV-Vis druhé derivace s dalšími spektroskopickými metodami (CD, fluorescence) pro komplexnější profil struktury.
• Využití strojového učení pro automatizovanou analýzu spektrálních dat a zvýšení objektivity hodnocení konformace.
• Rozšíření aplikace na další biotechnologické produkty, jako jsou fúzní proteiny či rekombinantní enzymy.

Závěr

Studie potvrdila, že Agilent Cary 60 UV-Vis spektrofotometr poskytuje dostatečnou citlivost a přesnost pro porovnání inovátoru a biosimiláru rituximabu. Sledování druhé derivace absorpce nabízí ucelené a efektivní řešení pro hodnocení konformační stability mAb při denaturační zkoušce.

Reference

• Scott A., Wolchok J., Old L. Antibody therapy of cancer. Nat. Rev. Cancer. 2012;12:278–287.
• Udpa N., Million R. Monoclonal antibody biosimilars. Nat. Rev. Drug Discov. 2016;15:13–14.
• Pace C.N., Scholtz J.M. Measuring the conformational stability of a protein. In: Creighton T.E., editor. Protein Structure: A Practical Approach. New York: Oxford University Press; 1997. p. 299–321.
• Zheng K., Bantog C., Bayer R. The impact of glycosylation on monoclonal antibody conformation and stability. mAbs. 2011;3(6):568–576.
• Levine R., Federici M. Quantitation of aromatic residues in proteins: model compounds for second-derivative spectroscopy. Biochemistry. 1982;21:2600–2606.
• Mach H., Middaugh C.R. Simultaneous monitoring of the environment of tryptophan, tyrosine, and phenylalanine residues in proteins by near-ultraviolet second-derivative spectroscopy. Anal. Biochem. 1994;222:323–331.
• Agilent Technologies. Comparison of Biosimilar and Innovator Monoclonal Antibody Rituximab Using the Agilent 1260 Infinity Bio-inert LC System and Agilent OpenLAB Match Compare Software. App. note 5991-4920EN.
• Ragone R., Colonna G., et al. Determination of tyrosine exposure in proteins by second-derivative spectroscopy. Biochemistry. 1984;23(8):1871–1875.
• Katayama D., Nayar R., et al. Solution behavior of a novel type 1 interferon, interferon-τ. J. Pharm. Sci. 2005;94:2703–2715.