Difference in Quantifiable Concentration Ranges of UV-Vis Spectrophotometer and Fluorescence Spectrophotometer

Význam tématu

Spektrofotometrie UV-Vis a fluorescenční spektroskopie představují klíčové metody pro přesné stanovení koncentrace organických sloučenin v širokém rozsahu. Znalost limitů detekce, kvantifikace a linearity těchto přístupů je zásadní pro optimální výběr instrumentace v analytických laboratořích, zejména při monitorování nízkých koncentrací biologicky aktivních a průmyslových látek.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo porovnat citlivost, rozsah kvantifikace a linearitu kalibračních křivek UV-Vis spektrofotometru Shimadzu UV-2600i a fluorescenčního spektrofotometru RF-6000 při měření roztoků rhodamínu B. Experiment zahrnoval přípravu standardních roztoků v koncentracích od 0,003 do 5 μg/ml a vyhodnocení jejich absorpčních a fluorescenčních charakteristik.

Použitá metodika a instrumentace

Instrumentace:

• UV-Vis spektrofotometr Shimadzu UV-2600i
  – Rozsah vlnových délek: 300–700 nm, šířka štěrbiny 1,0 nm, vzorkovací krok 1,0 nm, střední rychlost skenu
• Fluorescenční spektrofotometr RF-6000
  – Excitační vlnová délka 544 nm, emisní rozsah 540–700 nm, šířky propustí Ex/Em 5,0 nm, rychlost skenu 600 nm/min, vzorkovací krok 1,0 nm

Metodika:

1. Příprava standardních roztoků rhodamínu B v rozsahu 0,003–5 μg/ml.
2. Měření absorpčních spekter při 544 nm (UV-Vis) a fluorescenčních spekter při 577 nm (RF-6000).
3. Vytvoření kalibračních křivek pro vysoký a nízký koncentr. rozsah, výpočet koeficientu korelace R².
4. Výpočet limitů detekce (3σ) a kvantifikace (10σ) na základě opakovaných měření blanku a kalibračních bodů.

Hlavní výsledky a diskuse

Kalibrace UV-Vis:

• Vysoký rozsah (0,31–5 μg/ml): R² = 0,9999
• Nízký rozsah (0,003–0,013 μg/ml): výrazný šum, snížená linearita (R² ≈ 0,9808)

Kalibrace RF-6000:

• Nízký rozsah (0–0,125 μg/ml): vynikající linearita (R² = 0,9991)
• Vysoký rozsah (>0,125 μg/ml): projev reabsorpce, pokles linearity (R² = 0,8091 pro 0–5 μg/ml)

Limity:

• UV-2600i – LLOQ 1,9×10⁻² μg/ml, LLOD 5,6×10⁻³ μg/ml
• RF-6000 – LLOQ 4,3×10⁻⁵ μg/ml, LLOD 1,3×10⁻⁵ μg/ml

Fluorescenční metoda vykázala citlivost vyšší více než 400× oproti UV-Vis díky detekci signálu nad nulovým pozadím.

Přínosy a praktické využití metody

Díky kombinaci obou technik lze pokrýt rozsah koncentrací od desítek nanogramů až po jednotky mikrogramů na mililitr. UV-Vis je vhodná pro vyšší koncentrace, fluorescenční spektroskopie pak pro ultra-nízké koncentrace biologicky aktivních či environmentálních vzorků.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další zlepšení citlivosti a rychlosti analýz díky:

• vývoji pulzních a vícevlnových excitačních zdrojů,
• pokročilým detektorům s nízkým šumem,
• mikrofluidním zařízením a integrovaným on-line senzorům,
• využití strojového učení pro optimalizaci kalibrací a korekci interferencí.

Závěr

Studie potvrdila, že fluorescenční spektroskopie RF-6000 umožňuje spolehlivou kvantifikaci rhodamínu B na úrovni desítek pikogramů na mililitr, zatímco UV-2600i UV-Vis spektrofotometr poskytuje robustní měření v širokém nízkém až středním mikrogramovém rozsahu. Volba metody by tedy měla odpovídat požadované citlivosti a rozsahu koncentrací.

Reference

• Shimadzu Corporation. Application News No. A615: Spectrophotometric Analysis – Difference in Quantifiable Concentration Ranges of UV-Vis Spectrophotometer and Fluorescence Spectrophotometer. First Edition, Aug. 2020.