Optimizing tissue preparation and storage for analysis of polyunsaturated fatty acids using Agilent’s FTIR imaging systems

Význam tématu

Analýza polynenasycených mastných kyselin v biologických tkáních je nezbytná pro pochopení jejich role v patologických stavech včetně neurodegenerativních onemocnění. Fourierova transformace infračervené spektroskopie (FTIR) s vysokým prostorovým rozlišením umožňuje lokalizovat a kvantifikovat PUFA na subbuněčné úrovni, přičemž správná příprava a skladování vzorků zásadně ovlivňuje přesnost výsledků.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem této studie bylo definovat podmínky přípravy a skladování tenkých řezů sítnice, které minimalizují oxidativní degradaci nenasycených vazeb PUFA. Autoři sledovali pokles charakteristických absorpčních pásů C=C-H a C=O při běžném i urychleném vystavení světlu a pokojové teplotě a navrhli doporučené protokoly pro spolehlivé FTIR zobrazování.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky

• Sítnice z 13 měsíců staré myši C57BL/6, kryosekce tloušťky 7 μm
• Zmrazení v isopentanu ochlazeném v dusíku a skladování při –70 °C

Instrumentace

• Agilent Cary 670 FTIR spektrometr spojený s mikroskopem Cary 620
• FPA detektor 64×64 pixelů, rozlišení 5,5 μm na pixel
• Režimy reflekce (MirrIR) a průchodu (BaF2)
• Spektra 4000–900 cm⁻¹, rozlišení 4 cm⁻¹, 256 akumulovaných skenů

Sledované pásy

• Olefinický C=C–H při 3012 cm⁻¹
• Lipidový karbonyl C=O při 1735 cm⁻¹

Hlavní výsledky a diskuse

Pod urychlenými podmínkami (denní světlo, pokojová teplota) došlo k téměř úplné eliminaci PUFA signálu do 48 hodin. Při běžném skladování v temnu a při pokojové teplotě byla ztráta méně dramatická, avšak pozorovatelná:

• Pokles ~8 % intenzity pásu C=C–H během prvních 14 dnů
• Cca 15 % úbytek po jednom měsíci
• Do osmi měsíců zbylo méně než třetina původní koncentrace PUFA

Karbonylový signál vykazoval menší pokles, což naznačuje vznik nových oxidativních produktů. Distribuce PUFA vizualizovaná 3D FTIR mapami odhalila nejvyšší koncentrace v diskech tyčinkových buněk (rod outer segments).

Přínosy a praktické využití metody

Optimalizovaný protokol přípravy a skladování zaručuje věrné spektrální znázornění PUFA bez významného šumu z oxidace. Výsledky pomáhají laboratořím definovat maximální interval mezi rozmražením a měřením, což je klíčové pro přesnou kvantifikaci v biomedicínském výzkumu i průmyslové QA/QC.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Vývoj ochranných nástřiků nebo stabilizačních činidel zabraňujících oxidaci
• Rozšíření metodiky na další typy tkání a lipidů
• Integrace s pokročilou chemickou zobrazovací analýzou a strojovým učením pro automatizované rozpoznávání biomarkerů
• Použití kryogenní FTIR mikroskopie pro další omezení degradace

Závěr

Studie potvrdila, že i při standardním skladování v temnu a suchu dochází k významné oxidativní degradaci PUFA ve tkáňových řezech již během několika týdnů. Pro co nejpřesnější FTIR analýzu je nutné provést měření bezprostředně po rozmražení a důsledně eliminovat vystavení vzorků světlu.

Reference

• Fraser T, Taylor H, Love S Neurochem Res 35 503–513 2010
• Hartmann T, Kuchenbecker J, Grimm MOW J Neurochem 103 159–170 2007
• Stitt DM, Kastyak-Ibrahim MZ, Liao CR, Morrison J, Albensi BC, Gough KM Vib Spectrosc 60 16–22 2012