Quantification of Cy3/Cy5 labeled RNA and ssDNA

Význam tématu

Precizní kvantifikace RNA a ssDNA označených fluorescenčními barvivy Cy3/Cy5 je klíčová pro řadu molekulárně biologických aplikací, včetně tvorby sond, mikročipových analýz a kvantitativních hybridizací. Přesné stanovení koncentrace a stupně značení (DoL) umožňuje optimalizovat experimenty a zlepšit reprodukovatelnost výsledků.

Cíle a přehled článku

Cílem application note je představit Unmix aplikace pro systémy Lunatic a Little Lunatic, které na základě analýzy UV/Vis spektra izolují přispívající spektrální komponenty. Aplikace umožňují oddělit signály RNA/ssDNA, Cy3, Cy5 a nežádoucích absorbujících látek, a na základě nich vypočítat koncentraci a DoL.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika spočívá v měření celkového UV/Vis spektra vzorku a jeho dekonvoluci pomocí předdefinovaných spektrálních profilů:

• Měření spektra na systémech Lunatic a Little Lunatic
• Analyse pomocí Unmix algoritmu izolující spektrální složky
• Blankování čistou vodou

Použitá instrumentace

• Lunatic System se softwarovými Unmix aplikacemi
• Little Lunatic System
• UV/Vis spektrofotometrická měření
• Čistá voda jako blank

Hlavní výsledky a diskuse

Unmix aplikace detekují a kvantifikují:

• ssDNA nebo RNA (hodnoty v ng/µl a pmol/µl)
• Cy3 a Cy5 (množství barviva v nmol/µl)
• Impurity (proteiny, guanidin-thiocyanát, azid, EDTA, citrát; v RNA aplikaci navíc fenol)
• Pozadí (turbidity, částice, hemoglobin)

Quality of fit (RRSE) indikuje procento nespecifikované části spektra; při hodnotách nad 2,5 % nebo A260 <0,5 OD systém upozorní a v případě potřeby kvantifikuje celkové nukleové kyseliny.

Přínosy a praktické využití metody

Unmix aplikace poskytují rychlou, jedno-krokovou analýzu, minimalizují zásahy uživatele a nabízejí komplexní reporty v několika formátech (HTML, XML, TXT, CSV, XLSX, PDF). Metoda zvyšuje efektivitu laboratorních workflow a podporuje spolehlivou kontrolu kvality.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření softwarových profilů pro další fluorescenční barviva a aplikace, integrace s LIMS a automatizovanými pipetovacími roboty, využití pokročilé algoritmiky a umělé inteligence pro optimalizaci dekonvoluce spekter a prediktivní analýzu kvality vzorků.

Závěr

Unmix aplikace na Lunatic systémech představují robustní a uživatelsky přívětivý nástroj pro přesnou kvantifikaci Cy3/Cy5 značené RNA a ssDNA. Díky automatizované analýze spektra a rozsáhlým možnostem reportingu přispívají k efektivnímu řízení experimentálních procesů v molekulární biologii.

Reference

- Unchained Labs. Quantification of Cy3/Cy5 labeled RNA and ssDNA. Application Note Rev B, 2020.