See it all with Uncle's full-spectrum analysis

Význam tématu

Měření termální stability proteinů je nezbytné pro vývoj biologických léčiv a optimalizaci jejich formulací. Kombinace termického rampování a detekce fluorescence poskytuje citlivé a real-time informace o strukturních změnách proteinů, včetně unfolded stavu a počátku agregace.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat multifunkční platformu Uncle, která umožňuje souběžné provedení label-free a dye-based analýz stability proteinů. Studie ukazuje, jak lze díky integrovaným detekčním metodám detailně charakterizovat unfolding a agregaci různých typů proteinů.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky proteinů – polyklonální bovinní IgG (2,2 mg/mL), β-laktoglobulin A (1 mg/mL) a ribonukleáza A (0,5 mg/mL) – byly připraveny v pufrech PBS nebo vodě. K analýze byly použity extrinsic sondy SYPRO Orange (400×), CPM (80 μM) a ANS (80 μM) připravené v DMSO. Měřené 9 μL vzorků v quartzových vícenásobných kyvetách bylo rampováno z 25 °C na 95 °C rychlostí 0,6 °C/min. Detekce probíhala pomocí plnospektrální fluorescence (250–720 nm), statického (SLS) a dynamického světelného rozptylu (DLS). Excitační vlnové délky byly 266 nm pro IgG, BLG a RNázu A a 473 nm pro SYPRO Orange.

Použitá instrumentace

• Platforma Uncle s řízením teploty 15–95 °C a uzavřenými vzorkovými komorami
• Detekční metody: plnospektrální fluorescence, statický (SLS) a dynamický světlý rozptyl (DLS)
• Lasery pro excitaci: 266, 473 a 660 nm
• Quartzové multi-well kyvety s objemem 9 μL, kapacita až 48 paralelních vzorků

Hlavní výsledky a diskuse

• U bovinní IgG byly Tm hodnoty získané intrinsickou fluorescence a SYPRO Orange fluorescence podobné. SLS ukázalo mírné zpoždění vzniku agregátů v přítomnosti SYPRO Orange, pravděpodobně díky ochraně volných hydrofobních míst.
• Ribonukleáza A s ANS byla analyzována pomocí barycentrického průměru (BCM), přičemž vyšší koncentrace fosfátového pufru zvyšovala Tm, což odpovídá literárním poznatkům.
• β-laktoglobulin A doplněný o CPM vykazoval při zvyšující se teplotě vzrůst fluorescence v oblasti 400–650 nm, odrážející expozici volných cysteinů, a Tm přibližně 60 °C.

Přínosy a praktické využití metody

• Souběžné získání informací o unfoldingu, agregaci a velikosti proteinů v jediném experimentu
• Flexibilita využití label-free i dye-based přístupů pro široké spektrum proteinů
• Aplikace ve vývoji biologik, optimalizaci formulací a screeningových platformách

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj fluorescentních sond, zvýšení paralelní propustnosti měření a integrace s umělou inteligencí pro automatizované vyhodnocování dat umožní rychlé a detailní screenování stability membránových proteinů, komplexů a nových biologických molekul.

Závěr

Platforma Uncle nabízí komplexní řešení pro charakterizaci termální stability proteinů kombinací plnospektrální fluorescence a světelného rozptylu. Umožňuje detailní analýzu unfoldingu a agregace napříč různými typy proteinů a fluorescentními sondami v jednom běhu.

Reference

• 1. Jarasch A., et al. Developability assessment during the selection of novel therapeutic antibodies. Journal of Pharmaceutical Sciences, 2015;104(6):1885–98.
• 2. He F., et al. Detection of IgG aggregation by a high throughput method based on extrinsic fluorescence. Journal of Pharmaceutical Sciences, 2010;99(6):2598–608.
• 3. Semisotnov G., et al. Study of the molten globule intermediate state in protein folding by a hydrophobic fluorescent probe. Biopolymers, 1991;31(1):119–28.
• 4. Sigma-Aldrich Product Description for 8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid ammonium salt.
• 5. Stelea S., et al. Thermal unfolding of ribonuclease A in phosphate at neutral pH: deviations from the two-state model. Protein Science, 2002;10(5):970–8.
• 6. Alexandrov A., et al. Microscale fluorescent thermal stability assay for membrane proteins. Structure, 2008;16(3):351–9.